Combinando corante lipofílico, In situ Hibridação, imunohistoquímica e histologia

1. Injeção de corante lipofílico Preparação do tecido: Todas as dissecções de tecidos e manipulações são realizadas em animais fixados em paraformaldeído 4% (PFA) em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) por perfusão transcardial usando bombas peristálticas com agulhas de tamanho apropriado. Tecidos podem ser armazenados em PFA 4% na geladeira por até 6 meses. Todas as preparações e manipulações são realizadas em 0,4% ou PFA maior até que a montagem com glicerol para a imagem latente. Esta quantidade de PFA elimina eficazmente RNases e preserva o RNA de hibridização in situ. Armazenamento de corante: Todos os corantes devem ser armazenados em um compartimento escuro fechado para minimizar a circulação do ar e exposição à luz do dia, como eles são fotossensíveis. Para evitar a contaminação cruzada, um conjunto distinto de instrumentos devem ser usados ​​para lidar com cada corante. Primeiro, um local de aplicação para a tintura deve ser escolhido e tecidos estranhos extraído, a fim de confirmar visualmente o local escolhido, e acesso para a colocação do corante. Escolher o local de aplicação é o passo mais importante nesse processo. Escolher um bom local para rotular a população neuronal em consideração e não estruturas estranhos pode ser um desafio. A precisão da colocação em um trato dado sob controle visual no âmbito de dissecação exige um certo nível de entendimento da neuroanatomia em questão. Corante pode ser colocado central ou perifericamente para rotular projeções periféricas ou centrais, respectivamente, conforme necessário para um determinado projeto (ou seja, do cérebro, nervos periféricos, ouvidos, olhos). Corantes Lipophic vai difusa em todos os processos que pertencem a um determinado neurônio, tanto retrógrada e anterógrada, preenchendo um neurônio dado ou todos os neurônios projetando-se para uma determinada faixa. NeuroVue tintura de MTTI vem pré-carregado em tiras de filtro para uma fácil aplicação. Tintura também pode ser dissolvido em DMSO 100% (de trabalho sob o capô) e cabelo fino pode ser embebido nesta solução e, posteriormente, secas para aplicações menores. O corante de papel de filtro pré-carregados é cortado em pedaços de tamanho adequado triangular com microtesoura. O tamanho da tintura vai depender do tamanho da amostra, tamanho da estrutura que está sendo rotulada, eo número de cores sendo usadas simultaneamente. Certifique-se de corte tão pequeno de uma peça possível para evitar a rotulagem outras estruturas. Depois de usar microsissors para corte e pinças para a manipulação do corante agitar os instrumentos em álcool para remover qualquer resíduo de corante, em seguida, o ar seco completamente, ou dab com papel. Isso é para evitar a contaminação da amostra com corante residual em instrumentos que podem rotular estruturas indesejadas. Para inserção em tecidos moles, como o cérebro do filtro pode ser inserido diretamente usando um ponto do triângulo filtro para perfurar o tecido. Para mais tecidos rígidos fazer uma incisão para permitir a fácil inserção de corante. Não use uma agulha de dissecação para empurrar filtro em tecido. Isto pode causar colocação imprecisa e destruição do tecido. Inserir comprimentos de onda alternativa de NeuroVue dye, conforme necessário para a rotulagem de adicionais populações neuronais. Após a inserção do corante, e verificar a sua posição, as amostras são colocadas em um frasco bem fechada com PFA 4% e incubadas a 36 ° C no escuro por 2-14 dias, dependendo da idade e da distância a ser coberta de difusão (aproximadamente 2 mm por dia de 36 ° C). Um escopo dissecar com epiflouresence pode ser usado para avaliar se o corante foi difundida para o local desejado e, o modelo pode ser colocado de volta na incubadora se a difusão é considerada insuficiente. Usando um âmbito normal de dissecação sem epifluorescene para detectar a difusão irá subestimar o comprimento real do corante foi difundida. Além disso, se a concentração de corante é alta o suficiente para avaliar visualmente pode causar extinção absorção quando usando fluorescência emitida. O tecido desejado de interesse é dissecados e tudo montado numa lâmina com glicerol e lamínulas para a imagem latente com um microscópio confocal. Confocal configurações são como descrito em 1, 2. Se o tamanho do tecido inibe toda a montagem de um slide, o seccionamento serial é necessário (veja abaixo). Mais detalhes sobre a preparação do tecido para a imagem latente e corante propriedades espectrais estão disponíveis em: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Figura 1. Visão esquemática do experimento. O ouvido é exposto para permitir a visualização de todas as estruturas. Corante lipofílico é então injetado e permitiu a difusa. Depois de difusão distintas populações neuronais podem ser vistos rotulada pelo corantes diferentes. Em seguida, hibridização in situ (Sox2) é realizada no ouvido e expressão rótulos mRNA. Imuno-histoquímica é então realizado(Myo7 tubulina) para visualizar a expressão da proteína. Seguido por cortes histológicos em que ambos hibridização in situ e imunohistoquímica pode ser visualizado. 2. Hibridização In Situ No caso de você querer começar com a hibridização in situ (após o rastreamento com corantes lipofílicos será impossível), referem-se a preparação do tecido na parte 1. Cada lavagem, a menos que indicado, é realizado com 2 mL de solução a temperatura ambiente em um inversor / mixer. Certifique-se de trabalhar em um ambiente limpo RNase, livre. Desidratam e depois hidratar amostras através de uma série de metanol classificados. 100% uma hora durante a noite @ 4 ° C (opcional: amostras de armazenar a -20 ° C em metanol 100%) 75% x 5 min. @ 4 ° C 50% x 5 min. @ 4 ° C 25% x 15 min. @ 4 ° C (ou até sumidouros de tecido) Transferência de amostras para um tubo eppendorf de 2 mL (RNase free). Lavar três vezes em PBS (1x PBS) e transformá-forno de hibridização em para uso futuro (60 ° C). PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Digest tecido com 2 mL de 20 mg / ml de caldo de Proteinase K (Ambion Cat # AM2546) em 2,0 mL fresco PBS. Tempo de digestão real PK depende da idade do embrião. O seguinte é uma estimativa aproximada de vezes. Digestão devem ser cuidadosamente monitorizados como deproteination é uma etapa crítica. Sob-digestão irá resultar na penetração da sonda pobres enquanto mais-digestão resultará em uma perda de integridade estrutural. Um bom indicador da digestão é uma mudança no tecido de opaco para quase claro. Tabela 1. Proteinase K tempo de digestão no tecido mouse. AGE (dia embrionário) TEMPO (minutos) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Parar a digestão, incubando amostras em PFA 4% para 5 min. Lavar em PBS. PBS x 1 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Descartar PBS com especial atenção para eliminar o máximo possível. Prehybridize amostras: Incubar a 60 ° C em inversor em 1,8 mL mix de hibridização por pelo menos 1 hora. Definir IsoTemp bloco de aquecimento a 85 ° C para uso futuro. Como uma hora se aproxima, o DNA do esperma de salmão desnaturar (Invitrogen Cat. 15632-011) por incubação a 85 ° C por 10 min. Situado no gelo até o uso. Depois de pelo menos 1 hora de prehybridization, adicionar 200 mL ssDNA desnaturado e cerca de 100ng da DIG-rotulados riboprobe para cada amostra. Hibridizar durante a noite a 60 ° C em forno de hibridização. Substituir mix de hibridização com 2 mL 2X SSC. Conjunto de blocos de calor IsoTemp a 37 ° C e 70 ° C para uso futuro. Lavar com 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C em forno de hibridização. Lavar com 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C em forno de hibridização. Lavar com 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C em forno de hibridização. Lavar com 2X SSC x 60 min. @ 70 ° C em IsoTemp bloco de aquecimento. 70 ° C elimina qualquer atividade endógena de fosfatase alcalina. Este é talvez o passo mais significativo para a redução de fundo. Parte (d) pode ser dividida em duas 30 min. lavagens para minimizar os danos ao tecido. Lavar com PBS x 5 min. Uma enzima RNase descongelar em gelo para uso futuro. Substituir PBS e adicionar 1,0 mL de RNase Enzyme A (Fermentas EN0531 10mg / mL) x 60 min. @ 37 ° C em IsoTemp bloco de calor (a 90 min período. Incubação é preferível que a sonda é altamente concentrado). Descartar PBS / RNase A e lavar 4 vezes. 1X solução de lavagem x 10 min. 1X solução de lavagem x 10 min. 1X solução de lavagem x 10 min. 1X solução de lavagem x 60 min. @ 70 ° C em IsoTemp bloco de aquecimento. Incubar em 1X tampão Bloco por 1 hora. Neste momento, prepare 2,0 mL de buffer do bloco e 1 mL (1:2000) Anti-digoxigenina anticorpos por amostra. Inverter brevemente e deixe descansar a 4 ° C até o uso. Depois de 1 hora descartar buffer do bloco e adicionar 2,0 mL de buffer do bloco pré-absorvidos + de anticorpos nas amostras. Incubar durante a noite. Eliminar a solução de bloco. Lavar com 1X tampão de lavagem. 1X tampão de lavagem x 5 min. 1X tampão de lavagem x 5 min. 1X tampão de lavagem por 1 hora x 5-6 alterações. Lavar com 1X tampão de lavagem durante a noite. Enxágüe com 1X detection tampão por 10 min. Transferência de amostras em tampão de detecção de placa também. Remover buffer e detectar com BM Purple (Roche 11442074001) até a potência do sinal desejado é obtido (com sondas mais isso pode significar overnight). BM púrpura é sensível à luz cobrir com papel alumínio ou uma caixa. Mix BM Púrpura bem antes de usar. Certifique-se que as amostras estão flutuando livre e não preso aos poços. Verifique o sinal depois de 1 hora. Enxágüe amostras com tampão 1X detecção em poços x 5 min. Imagem ou amostras de loja em PFA 4% a 4 ° C. * As amostras podem ser visualizados nesta fase e / ou após a etapa de imuno-histoquímica é adicionado (Parte 3 abaixo). Soluções: Água livre de nuclease: Misture 1 mL DEPC (Sigma) com água ultrapura estéril 1L. Autoclave. 1X PBS: Misture 1 pacote de PBS (Sigma) em 1L de água livre de nuclease e filtro de esterilizar. 1X Solução de Lavagem: Misturar 450 mL de água livre de nuclease + solução de lavagem 50 mL de 10x e filtro de esterilizar. Mix de hibridização: Formamida 50% em volume (25 mL); 50% 2X SSC em volume (25 mL); 6% sulfato de dextran em massa (3G). 1X tampão de detecção: Mix tampão de detecção de 50 mL com 450 mL 10X de água livre de nuclease e filtro de esterilizar. 1X tampão Block: 5 mL tampão ácido maleico 10X (Roche set buffer); 40 mL água livre de nuclease, 5 mL de buffer do bloco 10X. 2X SSC: Misturar 50 mL 20X SSC com 450 mL de água livre de nuclease e filtro de esterilizar. Metanol classificados: Diluir metanol 100% com água livre de nuclease para 75%, 50%, e as concentrações de 25%. 3. Imuno-histoquímica Etapas 1 e 2 pode ser omitido se Parte 2 foi concluída. Nesse caso, certifique-se que todas as glicerol ou outros meio de montagem é lavado. Note que nem todos os anticorpos ainda será capaz de detectar a sua epítopo após proteinase K digestão. Nós temos uma pequena lista de anticorpos que podem ser usados ​​em combinação com hibridização in situ em tecidos de mamíferos, que mantêm a sua especificidade (ver Tabela 2). Série de etanol classificados para livrar o tecido de corantes lipofílicos (se não for concluída a efeito na Parte 2):.. 5min etanol a 50%, 70% de etanol 5 min, o etanol 95-100% durante a noite ou conforme necessário até efeito desejado, o etanol 70% 5 min., 5min etanol a 50%. Reidratar por incrementalmente adicionando PBS em 5-10 minutos. Bloco de tecido para 1 h em 2,5% de soro normal de cabra (NGS) e 0,5% Triton X-100 @ RT em shaker. (01:01 NGS 5%: 1,0% tritonX-100 em 1x PBS) Incubar com anticorpo primário (s) diluído em solução de bloco 48-72 hrs @ 4 ° C em shaker. Lavar com PBS para 1hr x 3 alterações. Bloco como no passo 3. Incubar com anticorpo secundário (s) diluída em solução de bloco para 12-24h @ 4 ° C em shaker (corantes Alexa Fluor ® da Invitrogen foram usados). Lavar como no passo 5. (Opção:.. Contra mancha com Hoechst nuclear mancha como a primeira lavagem diluir 10mg / ml de caldo de 1:2000 em PBS Siga com 1 hr lavagens em PBS x 2-3 mudanças RT @ no shaker) Imaging: As amostras podem ser visualizados nesta etapa com os dois de transmissão e microscopia de epifluorescência, preferencialmente usando um sistema de imagem confocal para a resolução acrescentou. Para fazer isso, rotineiramente ouvidos montagem toda em glicerol usando lamínulas como espaçadores para evitar o excesso de compressão do tecido. Além ou em vez desta imagem montar todo, as amostras podem ser embutidas em resina epóxi e seccionados para maior detalhes histológicos. Para se beneficiar da análise combinada de montagem / seção inteira, evitar o branqueamento do sinal fluorescente na etapa de imagem confocal. Soluções Soluções de etanol: Diluir 100% de etanol em água destilada para concentrações finais de 50% e 70%. Solução bloco: 01:01 NGS diluição de 5%: 1,0% tritonX-100 em 1x PBS (final concentrações de trabalho: NGS 2,5%, 0,5% tritonX-100). 1X PBS: Misture 1 pacote de PBS (Sigma) em água destilada 1L. 5% NGS: Descongele 2,5 NGS mL e misturar com 47,5 mL 1x PBS. Armazenar a 4 ° C. 1,0% tritonX-100: Mix 49,5 mL 1x PBS com 0,5 mL tritonX-100 (deixar no shaker RT @ para misturar por 1 hora). Armazenar a 4 ° C. Hoechst solução estoque mancha: Dissolver 10mg Hoechst corante por mililitro de 1x PBS. Tabela 2. Anticorpos que trabalham com proteinase K tecido digerido. Cat # Item Vendedor 25-6790 Anti-Miosina VIIA policlonais Proteus Biosciences 25-6791 Anti-Miosina VI policlonais Proteus Biosciences 9661 Caspase-3 policlonais Sinalização celular T7451 Anti-acetilados Monoclon tubulinaal Sigma PRB-238C Prox1 policlonal Covance 4. Histologia Histologia pode ser introduzida após Parte 1 para aumentar a resolução do corante lipofílico rastreamento em toda espessura montagens, tais como cérebro juvenil ou após a conclusão das partes 2 ou 3. Para seções de série do cérebro, recomendamos o Compresstome VF-700 micrótomo (Precisionary Instruments Inc., Greenville, Carolina do Norte) para obter espessura uniforme. Cortes congelados são menos ideal devido à maior infiltração de corante durante o processo de corte 3. Preparação de cortes seriados e montagem em glicerol 4 é o método preferido de preparação do tecido, quando monta todo ou montagens de superfície não permitem visualização adequada das regiões do tecido de interesse. Tecido também pode ser posteriormente incluídos em resina epóxi e cortados em espessura de 1-2 mM usando facas de vidro ou de diamante para TEM. Ao usar esta técnica de imunofluorescência permanecerá mais e é ainda mais estável após a incorporação de plástico, no entanto, todo o rastreamento lipofílico será inteiramente perdido nesta fase, eles se dissolvem em resina epoxy e álcool. Tomar precauções como amostras será sensível à luz até que sejam incorporados. Para Compresstome corte micrótomo VF-700, seguir as recomendações do Precisionary Instruments Inc. Incorporação de epóxi / Seccionamento: Fixação: 2,5% gluteraldehyde / PFA 1% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) 1hr durante a noite. Em um copo de amostra de tecido desidratar frasco: etanol 30% (5min.), etanol a 50% (5min.), etanol a 70% (5min. durante a noite), etanol a 95% (10min 5x cada um.) E etanol absoluto (10min 5x . cada). Transição Solvente: 1:01 etanol absoluto: óxido de propileno (PO) por 5 min. Solvente: 10min apenas 5x PO. cada um. Infiltração com resina: 01:01 PO: overnight resina em shaker. Despeje solução com a amostra (s) em moldes de incorporação plana e sair em contra 4-6 horas para evaporar PO. Como alternativa, remova a tampa do frasco e deixar em shaker por 4 horas (funciona bem com o maior tecido). Transferência de amostras de resina a 100% por 4 horas. Incorporar em resina no molde final com etiqueta. Polimerizar por incubação a 60 ° C por 24-48 horas. Corte de blocos com uma lâmina de barbear, conforme necessário para minimizar resina estranhas. Corte 1-2 hum cortes seriados em um ultramicrótomo (Reichert Ultracut um E-Jung foi usado). Montagem e imagem através de microscopia de epifluorescência. Opcional: Stain uma parte das seções com manchas histológicos (azul ou seja Stevenel é), se desejar (imunofluorescência perceber não será sustentada nestas seções). Soluções Soluções de etanol: Diluir 100% de etanol em água destilada para 30%, 50%, 70% e 95% de concentração. Solução de fixação: Misture 2,5 mL Gluteraldehyde 50%, 5 mL paraformaldeído 10%, e 42,5 mL 0,1 M de tampão fosfato pH 7,4 (concentração final: gluteraldehyde 2,5%, 4% PFA). Armazenar a 4 ° C. Resina epóxi: Faça de acordo com instruções fornecidas com Poly 812 Incorporação / Bed Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc. # 08792-1). Armazenar a -20 ° C. 5. Resultados representante Figura 2. Colocação de corante lipofílico e imagem em um embrião de rato. Corantes Três comprimento de onda diferente lipofílico foram injetados e incubado para permitir a visualização do nervo trigêmeo (TN), nervo glossofaríngeo (GN), e do nervo vago (VN) projeções central. A) a colocação de corantes lipofílicos nas porções periférica de três nervos cranianos para permitir a difusão para o tronco cerebral para a visualização de seus processos central. A TN é rotulado com NeuroVue Vermelho, GN: Maroon NeurVue e VN: Jade NeuroVue. B) O mesmo que no rato (A) após incubação. Alguns de difusão podem ser vistos com microscopia de campo claro. C) mouse mesmo que em (A e B). O rombencéfalo tem sido dissecado e plana montada. Alguns rotulagem dos processos centrais das três nervos rotulados podem ser vistos com microscopia de campo claro. D) a imagem de Confocal (C). Com o uso dos neurônios confocal específico pode ser visto, e uso de três diferentes corantes permite a avaliação da distribuição de cada população em relação aos outros. Corantes foram fotografadas seqüencialmente. Jade NeuroVue foi fotografada em uma excitação de 488 nm e emissão de 500-550 nm. NeuroVue Red foi fotografada em uma excitação de 535 nm e emissão de 550-600 nm. Maroon NeuroVue foi fotografada em uma excitação de 643 nm e emissão a 650-700 nm. Figura 3. Visão esquemática do experimento. O ouvido é exposto para permitir a visualização de todas as estruturas. Corante lipofílico éentão injetado e permitiu a difusa. Depois de difusão distintas populações neuronais podem ser vistos rotulada pelo corantes diferentes. Em seguida, hibridização in situ (Sox2) é realizada no ouvido e expressão rótulos mRNA. Imuno-histoquímica é então realizado (Myo7 tubulina) para visualizar a expressão da proteína. Seguido por cortes histológicos em que ambos hibridização in situ e imunohistoquímica pode ser visualizado.