Объединение Липофильные краситель, На месте Гибридизация, иммуногистохимии, и гистологии

1. Липофильные Dye инъекций Ткань приготовления: Все ткани вскрытия и манипуляции проводятся на животных фиксировали в 4% параформальдегида (PFA) в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), по transcardial перфузии использованием перистальтического насоса с соответствующего размера иглы. Ткань может быть сохранен в 4% PFA в холодильнике до 6 месяцев. Все препараты и манипуляции проводятся на 0,4% или выше PFA до монтажа с глицерином для работы с изображениями. Это количество PFA эффективно устраняет РНКазы и сохраняет РНК на месте гибридизации. Dye хранения: Все красители должны храниться в темном закрытом отсеке, чтобы минимизировать циркуляцию воздуха и воздействия ярком дневном свете, так как они светочувствительных. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, отдельный набор инструментов следует использовать для обработки каждого красителя. Во-первых, веб-приложение, для красителя должен быть выбран и посторонних тканей извлеченный для того, чтобы визуально подтвердить выбранное место, а также доступ для размещения красителя. Выбор веб-приложение, является самым важным шагом в этом процессе. Выбор хороший сайт для обозначения нейронов населения на рассмотрении и не посторонний структур может оказаться непростой задачей. Точность размещения в данном тракта под визуальным контролем в анатомическом театре сферы требует определенного уровня понимания нейроанатомии идет речь. Краска может помещаться либо централизованно или периферического маркировать периферической или центральной проекции, соответственно, сколько необходимо для данного проекта (например, мозга, периферических нервов, ухо, глаз). Lipophic красителей будет диффундировать во всех процессах, принадлежащих данному нейрон, как и ретроградно anterogradely, наполнение данного нейрона или все нейроны, выступающих в данном треке. NeuroVue красителя из MTTI поставляется с предварительно загружены на фильтр полосы для легкого применения. Краска также может быть распущен в 100% ДМСО (работа под капотом) и тонкие волосы могут быть промыты в этом растворе, а затем сушат в течение небольших приложений. Предустановленной фильтр красителем бумаги разрезают на соответствующего размера треугольных частей с microscissors. Размер краситель будет зависеть от размеров образца, размер структуры получить ярлык, и количество цветов, используемых одновременно. Не забудьте вырезать как небольшие куска, чтобы избежать маркировки других структур. После использования microsissors для резки и щипцы для обработки красителем агитировать инструменты в спирте, чтобы удалить какой-либо красителя вычетов, то высохнуть полностью, или мазок с бумагой. Это сделано во избежание загрязнения образца с остаточной красителя на инструментах, которые могут этикетке нежелательных структур. Для вставки в мягкие ткани, такие как мозг фильтр может быть непосредственно вставляются с помощью точки фильтр треугольник, чтобы проникнуть в ткани. Для более жесткой ткани делают надрез, чтобы облегчить введение красителя. Не используйте рассекает иглы выдвинуть фильтр в ткани. Это может привести к неточным размещения и разрушение тканей. Вставьте альтернативные длины волн NeuroVue краситель, сколько необходимо для маркировки дополнительные нейронные популяции. После введения красителя, и проверка его положение, образцы помещают в плотно закрыть флакон с 4% PFA и инкубировали при 36 ° С в темноте в течение 2-14 дней в зависимости от возраста и диффузии расстояния должны быть охвачены (примерно 2 мм на день при температуре 36 ° С). Рассекает область с epiflouresence могут быть использованы для оценки, если краситель имеет диффузную в нужное место, и образец может быть помещен обратно в инкубатор, если диффузия считается недостаточным. Использование нормального рассекает сферу без epifluorescene для обнаружения диффузии будет недооценивать истинная длина краситель имеет диффузную. Кроме того, если концентрация красителя достаточно высока, чтобы ослов визуально это может привести к поглощению закалки при использовании излучаемого флуоресценции. Желаемой ткани интерес рассечена, и весь установлен на слайд с глицерином и coverslipped для работы с изображениями с конфокальной микроскопии. Конфокальной настройки, как описано в 1, 2. Если ткань размером тормозит весь монтаж на слайд, серийный секционирования необходимо (см. ниже). Более подробную информацию о подготовке ткани для работы с изображениями и красителя спектральные свойства доступны по адресу: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Рисунок 1. Схема обзор эксперимента. Ухо подвергается позволяет визуализировать все структуры. Липофильные красителя затем вводится и позволили диффузным. После диффузии различных нейронных популяций можно увидеть помечены различными красителями. Далее, в гибридизация (Sox2) осуществляется на ухо и этикетки экспрессии мРНК. Immunohistochemistry Затем проводится(Myo7, тубулина) для визуализации экспрессии белка. Вслед за гистологических срезов, в котором как в точке, гибридизации и иммуногистохимии могут быть визуализированы. 2. В гибридизация В случае, если вы хотите начать с в гибридизация (после чего трассировки с липофильных красителей будет невозможно), обратитесь к ткани подготовки в части 1. Каждый мыть, если не указано, осуществляется с 2 мл раствора при комнатной температуре на инвертор / смесителя. Будьте уверены, чтобы работать в чистой, свободной РНКазы окружающей среды. Дегидрировать и увлажняет образцы через градуированные серии метанола. 100% 1 час ночи при 4 ° C (опционально: хранить пробы при температуре -20 ° С на 100% метанола) 75% х 5 мин. @ 4 ° C 50% х 5 мин. @ 4 ° C 25% х 15 мин. @ 4 ° C (или до ткани стоков) Передача образцов 2 мл Eppendorf трубки (РНКазы бесплатно). Вымойте три раза PBS (1x PBS) и включите духовку на гибридизации для использования в будущем (60 ° С). PBS х 5 мин. PBS х 5 мин. PBS х 5 мин. Дайджест ткани с 2 мкл 20 мг / мл протеиназы К акции (Амбион Cat # AM2546) в 2,0 мл свежей PBS. Фактическое время пищеварения PK зависит от возраста эмбриона. Ниже приводится приблизительная оценка раза. Пищеварение необходимо внимательно следить, как deproteination является важным шагом. Заместитель пищеварения приведет к снижению проникновения зонда в то время как чрезмерное пищеварения приведет к потере структурной целостности. Хорошим показателем пищеварение изменение ткани от непрозрачного до почти ясно. Таблица 1. Протеиназы К пищеварения время на мышь ткани. AGE (эмбриональных день) Время (мин) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Стоп пищеварения путем инкубации образцов в 4% PFA в течение 5 мин. Стирать в PBS. PBS х 1 мин. PBS х 5 мин. PBS х 5 мин. PBS х 5 мин. Отменить PBS обращая особое внимание на устранение в максимально возможной степени. Prehybridize образцов: инкубировать при температуре 60 ° С на инвертор в 1,8 мл смеси гибридизации, по крайней мере 1 час. Установить IsoTemp тепла блока до 85 ° C для дальнейшего использования. Как один час приближается, денатурации ДНК спермы лосося (Invitrogen Cat номер 15632-011) путем инкубации при температуре 85 ° С в течение 10 мин. Установите на льду до использования. После по меньшей мере 1 час prehybridization, добавить 200 мкл денатурированного оцДНК и примерно 100ng из DIG-меченых riboprobe для каждого образца. Скрещиваться течение ночи при 60 ° С в гибридизации духовке. Замените гибридизации смешать с 2 мл 2X SSC. Установите блоки IsoTemp тепла до 37 ° С до 70 ° C для дальнейшего использования. Промыть 2X SSC х 10 мин. При 60 ° С в гибридизации духовке. Промыть 2X SSC х 10 мин. При 60 ° С в гибридизации духовке. Промыть 2X SSC х 10 мин. При 60 ° С в гибридизации духовке. Промыть 2X SSC х 60 мин. При 70 ° С в блок тепла IsoTemp. 70 ° C удаляет любые эндогенной активности щелочной фосфатазы. Это, пожалуй, самым значительным шагом на пути уменьшения фона. Часть (г) может быть разбит на два 30 мин. моет свести к минимуму повреждения тканей. Промыть PBS х 5 мин. Оттепель РНКазы фермента на льду для будущего использования. Замените PBS и добавьте 1,0 мкл РНКазы ферментов (Fermentas EN0531 10 мг / мл) х 60 мин. @ 37 ° С в IsoTemp тепла блок (90 мин. Инкубационный период предпочтительнее, если датчик имеет высокую концентрацию). Отменить PBS / РНКазы и промыть 4 раза. 1X промывочного раствора х 10 мин. 1X промывочного раствора х 10 мин. 1X промывочного раствора х 10 мин. 1X промывочного раствора х 60 мин. При 70 ° С в блок тепла IsoTemp. Инкубируйте в 1X Блок буфера в течение 1 часа. В это время подготовить 2,0 мл буфера блока и 1 мкл (1:2000) Анти-дигоксигенин антител в образце. Обратить кратко и пусть сидят при 4 ° С до использования. Через 1 час буфера блока отказаться и добавить 2,0 мл предварительно поглощается блок буфера + антитела к образцам. Инкубируйте ночь. Отменить решение блока. Промыть 1X промывочный буфер. 1X промывочный буфер х 5 мин. 1X промывочный буфер х 5 мин. 1X промывочный буфер в течение 1 часа 5-6 х изменений. Промыть 1X промывочный буфер в одночасье. Промыть 1X detectioн буфера в течение 10 мин. Передача образцов в буфер для обнаружения и пластины. Удалить буфера и обнаружить с Б. М. Фиолетовый (Roche 11442074001) до желаемого сигнала получается (с более длинными зондами это может означать, на ночь). Б. М. фиолетовый светочувствительных накрыть фольгой или коробку. Смешайте Б. М. Фиолетовый перед использованием. Убедитесь, что образцы свободное плавание и не пристало скважин. Проверьте сигнал через 1 час. Промыть образцов с 1X буфере обнаружения в скважинах х 5 мин. Изображение или хранить образцы в 4% PFA при 4 ° C. * Образцы могут быть отображены на данном этапе и / или после иммуногистохимии этапе работы мастера (часть 3). Решения: Нуклеазы свободной воды: Смешайте 1 мл DEPC (Sigma) с 1 л стерильной воды сверхчистых. Автоклав. 1X PBS: Смешайте 1 PBS пакета (Sigma) в 1 л воды без нуклеаз и фильтр стерилизуют. 1X Промывочный раствор: смешайте 450 мл нуклеазы свободной воды + 50 мл 10-кратный промывочный раствор и фильтр стерилизуют. Гибридизация Mix: 50% формамид по объему (25 мл), 50% 2Х SSC по объему (25 мл), 6% декстрана сульфата массы (3G). 1X Обнаружение буфера: Смешайте 50 мл 10X буфера обнаружения с 450 мл воды без нуклеаз и фильтр стерилизуют. 1X Блок буфера: 5 мл 10X Малеиновый буфера кислота (Рош буфера набора), 40 мл нуклеазы свободной воды, 5 мл 10X буфера блока. 2X SSC: Смешайте 50 мл 20х SSC с 450 мл воды без нуклеаз и фильтр стерилизуют. Градуированные метанол: Развести 100% метанола с нуклеазы свободной воды до 75%, 50% и 25% концентрации. 3. Иммуногистохимия Шаги 1 и 2 можно опустить, если часть 2 был завершен. В этом случае, убедитесь, что все глицерин или другие монтажные среды смывается. Заметим, что не все антитела все еще будет в состоянии обнаружить их эпитопа после переваривания протеиназы К. У нас есть шорт-лист антитела, которые могут быть использованы в сочетании с в гибридизация в тканях млекопитающих, поскольку они сохраняют свою специфику (см. таблицу 2). Градуированные серии этанола, чтобы избавить ткани липофильных красителей (если не завершена осуществить в части 2):.. 50% 5мин этанол, 70% этанола 5 мин, 95-100% этанола на ночь или по мере необходимости, пока желаемого эффекта, 70% этанола 5 мин., 50% этанола, 5 мин. Увлажняет путем постепенного добавления PBS в течение 5-10 минут. Блок ткани в течение 1 часа в 2,5% нормальной козьей сывороткой (NGS) и 0,5% Тритон Х-100 @ RT на шейкере. (1:1 5% NGS: 1,0% TritonX-100 в 1x PBS) Инкубируйте с первичным антителом (ы) разводят в блоке решения 48-72 часов при 4 ° С на шейкере. Промыть PBS за 1 час х 3 изменения. Блок, как в шаге 3. Инкубируйте с вторичными антителами (ы) разводят в блоке решения для 12-24 часа при 4 ° С на шейкере (Alexa Fluor ® красителей из Invitrogen были использованы). Вымойте, как в шаге 5. (Вариант:.. Счетчик пятно с Hoechst ядерной пятно в качестве первого мытья разбавленным 10 мг / мл акции 1:2000 в PBS Следуйте с 1 часа моется в PBS х 2-3 изменениях @ RT на шейкере) Получение изображений: Образцы могут быть отображены на этом этапе как с передачей и epifluorescent микроскопии, преимущественно использованием конфокальной системы визуализации для дополнительного разрешения. Для этого мы обычно все уши монтирования в использовании глицерина в качестве покровных прокладки чтобы избежать чрезмерного сжатия тканей. В дополнение или вместо всего этого изображения горы, образцы могут быть внедрены в эпоксидной смоле и серийно секционного для дополнительного гистологического деталей. Чтобы извлечь выгоду из объединенного целого смонтировать / раздел анализа, избежать отбеливания флуоресцентного сигнала в конфокальной шаг изображений. Решения Этанол решений: развести 100% этилового спирта в дистиллированной воде до конечной концентрации 50% и 70%. Блок Решение: 1:1 разведения 5% NGS: 1,0% TritonX-100 в 1x PBS (окончательный рабочий концентрациях: 2,5% NGS, 0,5% TritonX-100). 1X PBS: Смешайте 1 PBS пакета (Sigma) в 1 л дистиллированной воды. 5% NGS: Оттепель 2,5 NGS мл и смешивают с 47,5 мл 1x PBS. Хранить при температуре 4 ° С. 1,0% TritonX-100: Смешайте 49,5 мл 1x PBS с 0,5 мл TritonX-100 (выйти на шейкере @ RT перемешать в течение 1 часа). Хранить при температуре 4 ° С. Hoechst пятно решение складе: Растворите 10 мг красителя Hoechst на миллилитр 1x PBS. Таблица 2. Антитела, которые работают с протеиназы К переваривается ткани. Cat # Пункт Продавец 25-6790 Анти-миозина-VIIA Поликлональные Proteus Biosciences 25-6791 Анти-миозина-VI Поликлональные Proteus Biosciences 9661 Расколотая каспазы-3 Поликлональные Сотовые сигнализации T7451 Анти-ацетилированный тубулина Monoclonдр. Сигма PRB-238C Prox1 поликлональных Covance 4. Гистология Гистология может быть введена после того, часть 1 увеличить разрешение липофильный краситель трассировки в толстых тотальных таких как мозг несовершеннолетних или после завершения Части 2 или 3. Для серийных срезах мозга, мы рекомендуем Compresstome VF-700 микротома (Precisionary инструменты Inc, Гринвилл, Северная Каролина), чтобы получить равномерную толщину сечения. Замороженные срезы меньше оптимального из-за большей красителя утечки во время секционирования процессе 3. Подготовка серийных срезов и монтаж в глицерине 4 является предпочтительным методом подготовки ткани при тотальных или поверхности крепления не позволяют адекватной визуализации тканей регионах, представляющих интерес. Ткань также может впоследствии быть встроены в эпоксидной смоле и нарезать на 1-2 мкм толщиной с использованием стекла или алмазные ножи для ПЭМ. При использовании этой методики наиболее иммунофлюоресценции останется и даже более стабильным после пластических вложение, однако, все липофильные трассировка будет полностью потерял на этом этапе, как они растворяются в смоле алкоголя и эпоксидной смолы. Примите меры предосторожности, как образцы будут светочувствительных пока они не будут внедрены. Для Compresstome VF-700 микротома секционирования, следуйте рекомендациям Precisionary инструменты Инк Эпоксидные Встраивание / Секционирование: Фиксация: 2,5% gluteraldehyde / 1% PFA в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), 1 час, чтобы за одну ночь. В флаконе образца стекла обезвоживает ткани: 30% этанола (5min.), 50% этанола (5min.), 70% этанола (5min. на ночь), 95% этанола (5x 10 минут каждый.), А абсолютный этанол (5x 10мин . каждый). Переходные растворителей: 1:1 абсолютного этилового спирта: окиси пропилена (ПО) в течение 5 мин. Растворитель: PO только 5x 10мин. каждая. Проникновение со смолой: 1:01 ПО: смолы ночь на шейкере. Налейте раствор образца (ов) в плоские формы вложения и выйти на счетчик 4-6 часов для испарения ПО. Кроме того, удалить крышку флакона и оставьте на шейкере в течение 4 часов (хорошо работает с большим ткани). Передача образцов до 100% смолы в течение 4 часов. Добавить в смоле в окончательной форме с этикеткой. Полимеризации путем инкубации при температуре 60 ° С в течение 24-48 часов. Вырезать блок с лезвием, сколько необходимо для минимизации посторонних смолы. Вырезать 1-2 мкм серийных срезов на ультрамикротоме (Ultracut E-Reichert Jung был использован). Горы и изображения с помощью epifluorescent микроскопии. Дополнительно: Пятно часть секций с гистологической окраски (синие т.е. Stevenel), если желаемое (реализовать иммунофлюоресценции не будет устойчивым в этих разделах). Решения Этанол решений: развести 100% этилового спирта в дистиллированной воде до 30%, 50%, 70% и 95% концентрации. Фиксация решение: смешать 2,5 мл 50% Gluteraldehyde, 5 мл 10% параформальдегида, и 42,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 (конечные концентрации: 2,5% gluteraldehyde, 4% PFA). Хранить при температуре 4 ° С. Эпоксидная смола: Сделайте согласно инструкции, прилагаемой к Poly / Кровать 812 Вложение Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc # 08792-1). Хранить при -20 ° C. 5. Представитель Результаты Рисунок 2. Липофильные красителя размещения и обработки изображений в эмбриона мыши. Три различных длин волн липофильных красителей вводили и инкубировали чтобы визуализации тройничного нерва (TN), языкоглоточного нерва (GN), и блуждающий нерв (VN) центральной проекции. ) Липофильные размещения красителя в периферической части три черепных нервов, чтобы диффузия в ствол головного мозга для визуализации своих центральных процессов. TN помечена NeuroVue красный, GN: NeurVue Maroon, В. Н.: NeuroVue Jade. Б) То же мыши, как в () после инкубации. Некоторые диффузии можно увидеть микроскопии светлого. С) То же мыши, как в (А и В). Задний мозг была расчленена и плоские смонтирован. Некоторые маркировка центральных процессов трех нервов помечены можно увидеть микроскопии светлого. D) конфокальной образ (С). С использованием конфокальной специфические нейроны можно увидеть, а также использование трех различных красителей позволяет для оценки распределения каждой группы населения по отношению к другим. Красители были обследованы последовательно. NeuroVue Джейд была отображаемого в возбуждении 488 нм и излучения 500-550 нм. NeuroVue Красной отображаемого в возбуждении 535 нм и излучения 550-600 нм. NeuroVue Maroon был отображаемого в возбуждении 643 нм и эмиссии на 650-700 нм. Рисунок 3. Схема обзор эксперимента. Ухо подвергается позволяет визуализировать все структуры. Липофильные красительзатем вводят и позволили диффузным. После диффузии различных нейронных популяций можно увидеть помечены различными красителями. Далее, в гибридизация (Sox2) осуществляется на ухо и этикетки экспрессии мРНК. Immunohistochemistry Затем проводится (Myo7, тубулина) для визуализации экспрессии белка. Вслед за гистологических срезов, в котором как в точке, гибридизации и иммуногистохимии могут быть визуализированы.