Het meten van de 50% Hemolytische Complement (CH 50) Activiteit van Serum
Summary
De klassieke route wordt geactiveerd door antilichaam en culmineert in target cel lysis. De CH<sub> 50</sub> Test geeft een maat voor de complement activiteit van een serummonster. Deze video toont de stappen die betrokken zijn bij het bepalen van de CH<sub> 50</sub> Van een serummonster, de berekeningen en het interpreteren van de resultaten.
Abstract
Het complement systeem is een groep eiwitten die indien geactiveerd leiden tot cel-lysis doelgroep en bevordert fagocytose door opsonisch. Individuele complement componenten kunnen worden gekwantificeerd maar dit geen informatie over de activiteit van het pad te bieden. De CH<sub> 50</sub> Is een screeningstest voor de activering van de klassieke complement route (fig. 1) en het is gevoelig voor de vermindering, afwezigheid en / of nalaten van enig onderdeel van de route. De CH<sub> 50</sub> Test de functionele capaciteit van serum complement componenten van de klassieke route van schapen rode bloedcellen (SRBC) pre-coated met konijn anti-schapen rode bloedcellen antilichaam (haemolysine) lyseren. Bij het antilichaam-gecoate SRBC worden geïncubeerd met serum te testen, de klassieke route van complement is geactiveerd en hemolyse resultaten. Als een complement component afwezig is, de CH<sub> 50</sub> Niveau zal nul zijn, indien een of meer onderdelen van de klassieke route wordt verlaagd, wordt CH<sub> 50</sub> Zal worden verlaagd. Een vast volume van optimaal gesensibiliseerd SRBC wordt toegevoegd aan elk serum verdunning. Na incubatie wordt het mengsel gecentrifugeerd en de mate van hemolyse wordt gekwantificeerd door het meten van de absorptie van het hemoglobine vrij in het supernatant bij 540nm. De hoeveelheid van complement activiteit wordt bepaald door het onderzoeken van de capaciteit van de verschillende verdunningen van het serum te testen op antilichamen gecoate SRBC lyseren. Deze video beschrijft de experimentele stappen betrokken bij de analyse van het niveau van een aanvulling op de activiteit van de klassieke complement route.
Protocol
Discussion
De CH 50 test is onderworpen aan vele storingen. Sommige SRBC zijn kwetsbaarder dan anderen, wat resulteert in spontane hemolyse, dat is niets om de activiteit aan te vullen. De affiniteit van het konijn antilichaam varieert van partij tot partij en van een fabrikant naar de andere, dit heeft invloed op de hoeveelheid antilichaam dat bindt aan de SRBC. Ook het proces van sensibiliserende SRBC met antilichaam resultaten in cellen met verschillende hoeveelheden antilichaam coating de SRBC. Specimen verzameling …
Acknowledgements
De auteur wil graag Miss Lora Matthews bedanken voor het uitvoeren van de techniek en de heer Paul Shepherd voor de cinematografie. Dit project werd gefinancierd door de Universiteit van Zuid-Australië, Laboratoriumgeneeskunde programma.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sheep red blood cells | CSL | 2490201 | Use at 1% final | |
| Serum | Human serum | |||
| Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated | AdB Serotec | C12HSB | ||
| 96 well flat bottom plate | Sarstedt | 83.1839 | ||
| Veronal buffered saline | Use at 1x final | |||
| Waterbath | ||||
| Plate reader | ||||
| 37°C room/incubator |
