Análisis de los Rolling fisiológicos de E-selectina leucocitaria mediada por el endotelio microvascular

1. Preparación de hBMEC (HBMEC-60 Cell) monocapa en placas de Petri para la cámara de flujo Escudo de 35 x 10 mm cultivo de tejidos platos con 2 ml de fibronectina 20μg/ml (en PBS) durante la noche a 4 ° C o durante 3 horas a 37 º C. Aspirar la solución de fibronectina de los platos y añadir 1,5 x10 5 células HBMEC-60 [Media 199 con HEPES y glutamina, un 10% de SFB, 10% de suero humano, 5 unidades / ml de heparina, 1ng/ml recombinante factor de crecimiento de fibroblastos, 1% de penicilina- estreptomicina] para el plato y les permiten crecer a la confluencia> 90%. (Esto toma 2 días) Aspirar el medio de crecimiento y, en un máximo de regular la expresión de E-selectina, añadir un nuevo medio con IL-1β 50ng/mL de 4-6 horas. Monocapas de células ya están listos para rodar ensayo. Para bloquear la función E-selectina, neutralizantes anti-humana de E-selectina Moab (clon BBIG-E4 (5D11)) se pueden agregar a 20μg/ml de ~ 1 hora a 37 ° C. 2. Preparación de las células progenitoras hematopoyéticas KG1a de la cámara de flujo Células hematopoyéticas humanas KG1a progenitoras se cultivan hasta la confluencia (1×10 6 células / ml) en RPMI-1640 con glutamina y el 10% de SFB / 1% penicilina-estreptomicina y se pipetean directamente desde el frasco para su uso en el ensayo de cámara de flujo. El número de células se calcula utilizando un hemocitómetro y luego las células se resuspendieron a 1 x 10 6 células / ml en 10 mM HEPES con HBSS (H / H Buffer) y 2 mM de CaCl2 Las células se guardan en hielo hasta su uso en el ensayo. 3. Preparación de microscopio, cámara de flujo placas paralelas y bomba de jeringa (Figura 1) Figura 1. Ilustración de Análisis de placas paralelas de flujo de la Cámara. Microscopio invertido, bomba de Harvard jeringa, equipo de cámara / y de placas paralelas cámara de flujo se colocan en una disposición óptima para el análisis celular eficiente y reproducible. A su vez en el poder y fuente de luz para microscopio invertido y el poder de la bomba de jeringa y seleccionar el objetivo de 10x en el microscopio. Coloque 50 ml tubo cónico en el soporte y se llenan de H / H y 2 mM de CaCl2. Colocar 5 ml tubos de plástico en el soporte de tubos de ensayo por debajo del tubo cónico de 50 ml Coloque 60 ml jeringa en la bomba de jeringa (Asegúrese de que tanto el émbolo de la jeringa y el cuerpo son seguros). Adjuntar 3-way llave de paso para poner fin a 60 ml de la jeringa y coloque la jeringa de 5 ml de 3-way llave de paso. Lugar de flujo paralelo aparato Cámara (GlycoTech, Inc.) en platina del microscopio con el tubo de entrada a la derecha, el tubo de salida a la izquierda y tubo de vacío a la espalda. Conecte el tubo de vacío a vacío y válvula de aire libre para permitir que un aparato de placas paralelas a adherirse a la etapa. (Esta es la prueba si la falda de vacío en la cámara de flujo es hermético.) Cierre la válvula de aire. Conecte la línea de salida de la tubería (a la izquierda del microscopio) para 3-way llave de paso. Aparato está preparado para la puesta en plancha monocapa HBMEC-60. Lugar HBMEC-60 monocapa placa y el lugar en el centro del microscopio. Activar el vacío y la posición del aparato de la cámara de flujo por encima de la placa de tal manera que la plancha monocapa está en el centro. Baje suavemente el aparato de la cámara de flujo sobre la placa de monocapa HBMEC-60 y los aparatos que el flujo de la cámara de succión hacia abajo. (No debe haber ningún ruido de escape de aire y en este momento puede ser necesario aplicar una presión a la cámara para comprimir la junta de goma.) Una vez vacío, se ha establecido, tubo lugar la entrada (a la derecha) en el tubo de 50 ml cónicos que contengan H / H con 2 mM de CaCl2. Abierto de 3 vías llave de paso para permitir el flujo dentro de la jeringa 60 ml y la bomba a cabo en el "modo de la bomba." Para eliminar el aire de las líneas de entrada / salida sin necesidad de levantar las células en la placa, use la bomba de jeringa fijada en 2mL/minute para llenar el tubo de admisión, entonces rápidamente se puso a 0,5 ml / minuto justo antes de que el fluido llega al aparato. Es imperativo que este primer set con cuidado y evitar burbujas de aire que se levante la monocapa de la placa. Una vez que el líquido se ve que se mueven dentro de la jeringa de 60 ml, la cámara de flujo y bomba de jeringa se han preparado y la cámara de flujo está listo para su uso. Esta disposición se repetirá para cada corrida de entrada de la célula y en cada nueva placa es necesario. 4. La captura de los leucocitos Eventos Rolling utilizando elementos NIS Abrir NIS elementos en el escritorio. Pulse el botón "play" icono de la imagen en vivo. Exposición automática le permite ver la placa más fácil por el momento y es importante para el enfoque. Asegúrese de que microscopio se centra correctamente en la monocapa celular. Una vez centrado, vuelva a ajustar la exposición a una luz de marco / segundo y el ajuste en el microscopio. La imagen deberá aparecer en el ordenador y ya no será visible en el visor microscopio debido a la poca luz. Histograma de la luz puede ser adajustado para eliminar la exposición de fondo o mejorar la claridad de la célula. Haga clic en Bin Bin 2X2 o en vivo para obtener una imagen que es ideal para la captura de películas Haga clic en "Macro" en la barra de menú y selecciona "escribir en el puerto", seleccionar el puerto "COM3" y "abierto". (Se abre el puerto de coordinar con la bomba de jeringa. Pipeta de 1 ml de suspensión celular KG1a en el tubo de ensayo de 5 ml cerca de la línea de tubos de entrada y luego colocar la tubería de entrada de línea en la parte inferior del tubo de ensayo. Ir a la barra de menú, haga clic en "Capture", "lapso de tiempo de adquisición." Un nuevo menú pop-up. Seleccione el protocolo de 210 segundos que dura, esta es la duración del programa para el despliegue de HBMEC-60 células. (Cada fase está programada para tomar una foto cada segundo durante la duración del protocolo de la bomba. También es configurado para enviar un comando a través del puerto COM3 para arrancar la bomba.) Si lapso de tiempo se interrumpe, la bomba no se detiene por su propia cuenta y se debe restablecer. Pulse Cancel para volver a vivir de la imagen. Establecer la bomba de jeringa a "modo de programación", según el manual de instrucciones. (El modo de programación permite la programación manual de las tasas de flujo específico (es decir, los niveles de tensión de corte) que se imparte dentro de la cámara y dictar las interacciones KG1a de células durante el monocapa de células HBMEC-60.) Configuración de la celda KG1a rodando por las células hBMEC fueron los siguientes 4,2 dinas / cm 2 durante 45 s, 0,3 dinas / cm 2 durante 60 s, y el aumento progresivo cada 15 s hasta un máximo de 4,2 dinas / cm 2 La tensión de cizallamiento (W º) en la cámara se calculará de acuerdo con la siguiente ecuación: W = 6μQ st / a b 2, donde μ es la viscosidad del estimado de los medios de comunicación (0,0076 P), Q es el caudal en ml / s, a es la altura del canal (espesor de la junta) en cm (0,03 cm), y b es el ancho del canal en cm (0,5 cm). Los caudales se regula con el modo de programa de la bomba de jeringa. Microscopio y la computadora está listo para la captura de fotografías a intervalos. Pulse el botón "Inicio, Ejecutar" en el equipo para comenzar a adquirir los datos. Mientras se ejecuta el programa, asegúrese de agregar los medios de comunicación para el tubo de ensayo que contienen las células KG1a con el fin de mantener el tubo de entrada / salida completa del medio (Asegúrese de que no hay burbujas de aire). 5. La dependencia de sialilación Terminal y glicoproteína de superficie de E-selectina mediada por células KG1a 5. Rolling (Figura 2, Videos Clips de 5.1 a 5.5) Dosificación de los celulares KG1a rodando por no estimulados HBMEC-60 células. (Control negativo) las células KG1a se prepararon y se infunde en la cámara de flujo en vivo no IL-1β estimulada HBMEC-60 como se describió anteriormente. Dosificación de los celulares KG1a rodando por HBMEC-60 células pre-tratadas con IL-1β. (E-selectina, la dependencia de control de) las células KG1a se prepararon y se infunde en la cámara de flujo en vivo de IL-1β estimulada HBMEC-60 como se describió anteriormente. Dosificación de los celulares KG1a rodando por HBMEC-60 células pre-tratadas con IL-1β y luego neutralizar anti-humano de E-selectina Moab. (E-selectina, la dependencia de control) las células KG1a se prepararon y se infunde en la cámara de flujo en vivo de IL- 1β estimulada HBMEC-60 previamente con anticuerpos neutralizantes humanos E-selectina moAb como se describió anteriormente. Ensayo de la sialidasa digerir células KG1a rodando por IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pretratadas con 0.1U/ml Vibrio Cholerae neuraminidasa durante 1 hora a 37 ° C se prepararon y se infunde en la cámara de flujo en vivo de IL-1β estimulada HBMEC-60 como se describió anteriormente. Ensayo de la proteasa-digerido celular KG1a rodando por IL-1β estimulada HBMEC-60. KG1a células pretratadas con la proteasa, la bromelina 0.2U/ml durante 1 hora a 37 ° C, se prepararon y se infunde en la cámara de flujo en vivo de IL-1β estimulada HBMEC-60 como se describió anteriormente. 6. El análisis de NIS-Elements-Capturado células KG1a y graficación de datos celular KG1a Rolling Después de la secuencia de tiempo se adquiere, guarde los datos. Ir a "medida" pestaña en la barra de menú y selecciona "definir el umbral." Mueve las barras para que las células deseadas son de color rojo. Seleccionar "Todo" y luego "Aceptar". Todo el lapso de tiempo la secuencia debería ser ahora modificado con visibles las células rojas de rodadura. Ir a "medida" y seleccione "restricciones". (Las restricciones permiten al usuario excluir los objetos un umbral que no representan las células de laminación. Esto se debe principalmente el fondo creado por la monocapa HBMEC-60). Seleccione "zona" y un mínimo de entrada y los valores máximos para el área de las células de laminación. Repita este paso para "elongación" y "circularidad". Seleccione "medida" y seleccione "crear binarios con restricciones", y establecer los valores de restricción para optimizar el NIS-Elements software de reconocimiento de las células de rodar en monocapa de células HBMEC-60. Volver a "medida", seleccione "Los datos de campo", y luego seleccione "datos reset". Cerrar este menú. Volver a la "medida" y síSelect "campo de lectura". Abierta "Medida", "Los datos de campo", seleccione "número u objetos" y luego seleccionar "todos los campos" y exportar datos a Microsoft Excel. Seleccione "datos claros" para preparar NIS-Elements adquisición de celulares para la recolección de datos siguiente. Resultados: Figura 3. Análisis de placas paralelas cámara de flujo de E-selectina actividad de unión en las células KG1a. Las células tratadas con sialidasa KG1a o de la proteasa fueron analizadas para rodar la eficiencia en monocapas de HBMEC-60 células pre-tratadas con IL-1β. Control negativo rodar experimentos se llevaron a cabo también mediante el análisis de células KG1a rodando por no IL-1β estimulada HBMEC -60 células o la IL-1β estimulada HBMEC-60 células tratadas con anticuerpos neutralizantes humanos E-selectina Moab (5D11). Las frecuencias de celular móvil se realizaron por triplicado y se analizaron con NIS-Elements. (* Significación estadística, p <0,001) En este informe, basado en video, que proporciona una representación visual de cómo analizar los leucocitos – las interacciones de las células endoteliales en condiciones fisiológicas esfuerzo cortante. En particular, se analizó el papel de la E-selectina – E-selectina ligandos en la mediación de la inmovilización de leucocitos y laminados, un comportamiento adhesivo necesario para el compromiso de las actividades secundarias de unión más estable a través de receptores, como las integrinas y los receptores de ácido hialurónico. Usando la cámara de flujo de placas paralelas adaptado para su uso con un microscopio invertido, la bomba de Harvard jeringa, una cámara de vídeo y el ordenador / celular de adquisición de hardware, se realizaron experimentos en los que la E-selectina ligando + células KG1a se utilizaron como modelo de leucocitos y las células hBMEC (HBMEC- 60) estimulados con citoquinas pro-inflamatorias, IL-1β, fueron utilizados como la E-selectina + modelo humano de las células endoteliales (1-6). Como se informó anteriormente, se observó robusta célula KG1a rodando por IL-1β estimulada HBMEC-60 células en un rango de niveles de esfuerzo cortante en forma de E-selectina-dependiente (Figura 3) (diferencia estadísticamente significativa en comparación con las células KG1a rodando por no IL-1β HBMEC-60 estimula las células). Los controles negativos, que consistía en células KG1a rodando por no IL-1β estimulada HBMEC-60 o las células de la IL-1β estimulada HBEMC-60 células pretratadas con anti-humano de E-selectina mAb, se realizaron en paralelo para demostrar la dependencia de la estimulación de citoquinas y la expresión de E-selectina de la actividad de rodadura (Figura 3). Además, el análisis de rodadura de las células pretratadas con KG1a Vibrio cholerae neuraminidasa (sialidasa) o con la bromelina, una proteasa no específica conocida para la digestión de la E-selectina ligando glicoproteína de superficie, destacó la importancia de los residuos terminales de ácido siálico y la glicoproteína de superficie para la E-selectina ligando actividad (2,3).