ניתוח של הרולינג E-selectin בתיווך פיזיולוגי ליקוציט על כלי הדם האנדותל
Summary
דוח זה מספק תיאור ויזואלי של ניתוח מקבילות צלחת קאמרית תזרים לחקר אינטראקציות אנדותל ליקוציט תחת לחץ גזירה פיזיולוגי. שיטה זו שימושית במיוחד עבור חוקרים את התפקיד של E-selectin ligands האנדותל (E) ו-selectin ליקוציט כי ליקוציט ההדק מתגלגל על משטחים תא האנדותל.
Abstract
E-selectin הוא חלבון מסוג 1 הממברנה על לתאי אנדותל כלי הדם המסייעת ליזום גיוס במחזור leukocytes לרקמות, דלקת עורית העצם. E-selectin הביטוי הוא מכונן על microvessels עורי ועצמות והוא ועין מתנהלת על ידי תומכי ציטוקינים דלקתיים, כגון IL-1α / ו TNF-α, על microvessels ברקמות דלקתיות. קולטן זה לקטינים מתווכת אינטראקציות מחייב חלש עם נגד קולטן ligands פחמימות על leukocytes במחזור, שתוצאתה התנהגות מתגלגל אופייני. בגלל אינטראקציות אלה להקדים אירועים דבק יציב יותר פעילות diapedesis, אפיון של פעילות מתגלגל ליקוציט וזיהוי של E-selectin ligands ליקוציט כבר המטרות העיקריות בלימודי סחר דלקת ליקוציט ו ו בפיתוח ותרופות אנטי דלקתיות (1-5) . הכוונה של דו"ח זה היא לספק תיאור ויזואלי, מקיף של הטכנולוגיה ביותר בשימוש נרחב לחקר E-selectin E-selectin אינטראקציות ליגנד בתנאים פיזיולוגיים זרימת הדם. המעבדה שלנו בשיתוף עם המרכז למחלות עור הרווארד מחקר משתמשת המדינה-of-the-art מקבילות צלחת קאמרית תזרים מנגנון מלווה להדמיה דיגיטלית ותוכנות הקלטה חדשה, שקל-Elements. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לנתח אירועים הידבקות בזמן אמת להדמיה על המסך, כמו גם פעילות שיא מתגלגל בפורמט וידאו. הידבקות תא פרמטרים, כגון גלגול, תדירות התנגדות גזירה ומחייבת / קשירה יעילות, מחושבים באמצעות תוכנת שקל, יסודות, מיוצא גיליון אלקטרוני של Excel ו – נתון ניתוח סטטיסטי. בהפגנה שהוצגו כאן, אנחנו עובדים הקאמרית מקבילות צלחת תזרים לחקור E-selectin תלויי פעילות מתגלגל ליקוציט על חיים אנושיים לתאי מח עצם האנדותל (hBMEC). האדם hematopoietic KG1a ובתאים, המבטאים רמה גבוהה של ליגנד E-selectin, שימשו מודל ליקוציט שלנו, תוך תא הנציח hBMEC קו, HBMEC-60 תאים, שימש מודל תא האנדותל שלנו (6). כדי לגרום לדמות ביטוי יליד E-selectin בחדר זרימה, HBMEC-60 תאים הופעלו הראשון עם IL-1. מצגת וידאו שלנו הראו כי במקביל הצלחת ניתוח תזרים היא שיטה מתאימה ללימוד E-selectin בתיווך פיזיולוגי פעילויות מתגלגל ליקוציט וכי אפיון פונקציונלי של ליגנד E-selectin לויקוציטים (ים) בחדר זרימה ניתן לקביעה על ידי יישום פרוטאז או glycosidase digestions.
Protocol
Discussion
במקביל, צלחת לחדר ניתוח תזרים הוא התמחה מערכת assay חוץ גופית המשמשת ללמוד ליקוציט – אינטראקציות דבק אנדותל בתנאים מתח גזירה דומה לאלה הנחילה על פני השטח של ורדיד שלאחר נימי. כפי שמתואר כאן במצגת ויזואלית שלנו, אנחנו מדגימים את הערך של מערכת זו על חקירת תפקידו של E-selectin – E-selectin ligands בתיווך קשירה ליקוציט, מתגלגלים על פני השטח של כלי הדם האנדותל הופעל. כמו כן, אנו חושפים את היישום של glycosidase פרוטאז, טיפולים נוגדן חסימת הבהרת תפקידה של selectin-E ו ligands שלה במערכת זו. ניתוחים אלה הם לשעתקו מאוד לעזור להקים בסיס ניסיוני לחקר E-selectin – E-selectin פונקציה ליגנד in vivo.
בנוסף ללימוד הידבקות התא עם monolayers של ציטוקינים המופעל לתאי אנדותל כלי הדם (עורק הטבור hBMEC או אדם או עורי לתאי אנדותל כלי הדם), מבחני יכול להתבצע באמצעות מטוהרים רקומביננטי אנושי E-selectin או E-selectin-איג מולקולות chimeric כמו מצע עבור הידבקות התא. אינטראקציות דבק אחרים בתיווכם לויקוציטים (L-) ו-selectin טסיות דם (P)-selectin יכול להיות גם assayed באמצעות צלחת מקבילות קאמרית טכנולוגיה לזרום. על ידי שינוי סוג המצע תא monolayer / חלבון או של לויקוציטים קלט / selectin-transfectant מודלים תא, החוקרים יכולים ללמוד את התפקיד של אינטראקציות אלה בתנאים מתח פיזיולוגי גזירה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המימון לפרויקט זה סופק על ידי בפרס האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מחקר מלומד, (06-024-01-CSM צ'רלס ג'דימיטרוף); מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לסרטן מענק (RO1CA118124 צ'רלס ג'דימיטרוף); ו המכונים הלאומיים לבריאות / לאומי של דלקת מפרקים השלד והשרירים ועל מחלות עור מענק (P30 AR042689 ד"ר תומס ס 'קופר, מבית החולים בריגהאם לנשים, בוסטון, מסצ'וסטס).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FBS | SIGMA | F6178-500ML | ||
| DPBS | GIBCO | 14190 | ||
| 0.5 M EDTA | GIBCO | 15575-038 | ||
| 1M HEPES | GIBCO | 15630 | ||
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | ||
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | ||
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD FALCON | 353001 | ||
| Fibronectin , from human plasma | SIGMA | 86088-83-7 F2006-2MG | ||
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | SIGMA | I9401-5UG | ||
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO | 14170 | ||
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | ||
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | ||
| Heparin | Abraxis Pharmaceutical Products | 504011 | ||
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | ||
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | ||
| Plastic Test tubes | BD Bioscience | 352008 | ||
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | ||
| Bromelain | SIGMA | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).
