Analisi di fisiologica E-selectina-mediata rotolamento dei leucociti sull'endotelio microvascolari
Summary
Questo rapporto fornisce una rappresentazione visiva di piatti paralleli analisi del flusso della camera per lo studio delle interazioni tra leucociti endoteliale sotto fisiologiche sollecitazioni di taglio. Questo metodo è particolarmente utile per indagare il ruolo di endoteliale (E)-selectina e leucociti E-selectina ligandi che leucociti innescare rotolamento sulla superficie delle cellule endoteliali.
Abstract
E-selectina è un tipo-1 proteina presente sulla membrana delle cellule endoteliali microvascolari che aiuta a iniziare il reclutamento dei leucociti circolanti nei tessuti cutanei, ossei e infiammato. E-selectina espressione è costitutiva sul microcircolo cutaneo e ossa ed è inducibile da citochine pro-infiammatorie, quali IL-1α / e TNF-α, il microvasi nei tessuti infiammati. Questo recettore lectina media deboli interazioni di legame con carboidrati contro-recettore ligandi sui leucociti circolanti, che si traduce in un comportamento caratteristico di rotolamento. Poiché queste interazioni precedere eventi adesivo più stabile e attività diapedesi, caratterizzazione dei leucociti attività di rotolamento e l'identificazione dei leucociti E-selectina ligandi sono stati gli obiettivi principali degli studi di traffico dei leucociti e l'infiammazione e lo sviluppo di terapie anti-infiammatorie (1-5) . L'intento di questo rapporto è di fornire una visuale, descrizione completa della tecnologia più diffusa per lo studio di E-selectina E-selectina interazioni ligando in condizioni fisiologiche del flusso sanguigno. Il nostro laboratorio in collaborazione con il Centro di Ricerca Malattie della pelle Harvard utilizza un state-of-the-art a piatti paralleli apparato camera di flusso accompagnato da visualizzazione digitale e software di nuova registrazione, NIS-Elements. Questa tecnologia ci permette di analizzare gli eventi adesione in tempo reale per la visualizzazione sullo schermo così come l'attività di registrazione in sequenza in un formato video. Parametri di adesione cellulare, come la frequenza di rotazione, la resistenza al taglio e rilegatura / tethering efficienza, sono calcolati con NIS-Elements, esportati in un foglio Excel e sottoposti ad analisi statistica. Nella dimostrazione qui presentati, abbiamo impiegato i piatti paralleli camera di flusso per indagare E-selectina-dipendente l'attività dei leucociti che rotola su cellule di midollo osseo umano vivente endoteliale (hBMEC). Umane ematopoietiche cellule progenitrici KG1a, che esprimono un alto livello di E-selectina ligando, sono stati utilizzati come modello dei leucociti, mentre un immortalata linea cellulare hBMEC, HBMEC-60 cellule, è stato utilizzato come modello delle cellule endoteliali (6). Per indurre e simulare nativo E-selectina espressione nella camera di flusso, HBMEC-60 cellule sono stati attivati con IL-1. La nostra presentazione video ha mostrato che a piatti paralleli analisi del flusso è un metodo adeguato per lo studio fisiologico E-selectina-mediata dei leucociti al rotolamento e le attività che la caratterizzazione funzionale dei leucociti E-selectina ligando (s) nella camera di flusso può essere accertata mediante l'implementazione della proteasi o glicosidasi digestioni.
Protocol
Discussion
Piatti paralleli analisi camera di flusso è un sistema specializzato in test in vitro utilizzati per lo studio dei leucociti – interazioni adesive endoteliale in condizioni di stress di taglio simili a quelli impartiti sulla superficie di un post-capillari venule. Come illustrato qui nella nostra presentazione visiva, dimostriamo il valore di questo sistema per indagare il ruolo di E-selectina – E-selectina ligandi nella mediazione tethering leucociti e rotolando sulla superficie dell'endotelio microvascolare attivata. Ci rivelano anche l'applicazione della proteasi, glicosidasi e trattamenti anticorpi blocco per chiarire il ruolo di E-selectina e dei suoi ligandi in questo sistema. Queste analisi sono altamente riproducibili e aiutare a formare una base sperimentale per lo studio di E-selectina – E-selectina funzione di legante in vivo.
Oltre a studiare l'adesione cellulare con monostrati di cellule microvascolari citochina-attivati endoteliale (vena ombelicale hBMEC o umana o per assorbimento cutaneo delle cellule endoteliali microvascolari), le analisi possono essere eseguite utilizzando umana ricombinante purificata E-selectina o molecole chimeriche E-selectina-Ig come substrato per l'adesione cellulare. Interazioni adesive altri mediato attraverso leucociti (L-)-selectina e delle piastrine (P)-selectina possono essere analizzati utilizzando la tecnologia a piatti paralleli camera di flusso. Variando il tipo di cellule monostrato / proteine substrato o di leucociti ingresso / selectina-transfectant modelli cellulari, i ricercatori possono studiare il ruolo di queste interazioni in condizioni fisiologiche sollecitazioni di taglio.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questo progetto è stata fornita da un americano Society Scholar Award Cancer Research, (06-024-01-CSM di Charles J. Dimitroff), un National Institutes of Health / National Cancer Institute di sovvenzione (RO1CA118124 di Charles J. Dimitroff) e uno National Institutes of Health / National Institute of Arthritis e muscolo-scheletrico e malattie della pelle di sovvenzione (P30 AR042689 il Dr. Thomas S. Kupper, Brigham and Women Hospital, Boston, MA).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FBS | SIGMA | F6178-500ML | ||
| DPBS | GIBCO | 14190 | ||
| 0.5 M EDTA | GIBCO | 15575-038 | ||
| 1M HEPES | GIBCO | 15630 | ||
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | ||
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | ||
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD FALCON | 353001 | ||
| Fibronectin , from human plasma | SIGMA | 86088-83-7 F2006-2MG | ||
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | SIGMA | I9401-5UG | ||
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO | 14170 | ||
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | ||
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | ||
| Heparin | Abraxis Pharmaceutical Products | 504011 | ||
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | ||
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | ||
| Plastic Test tubes | BD Bioscience | 352008 | ||
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | ||
| Bromelain | SIGMA | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
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