Анализ Физиологические E-селектин-опосредованной лейкоцитов Роллинг на микрососудистой эндотелия

1. Подготовка hBMEC (HBMEC-60 ячеек) монослоя на чашки Петри для потока палаты Шерсть 35 х 10 мм, ткань-культуры блюд с 2 мл фибронектина 20μg/ml (в PBS) в течение ночи при температуре 4 ° С или в течение 3 часов при 37 ° C. Аспирируйте фибронектина решение от блюда и добавляют 1,5 x10 5 HBMEC-60 клеток [Средний 199 с HEPES и глютамина, 10% FBS, 10% человеческой сыворотки, 5 ед / мл гепарина, 1ng/ml рекомбинантный человеческий фактор роста фибробластов, 1% пенициллин- Стрептомицин] на блюдо и дать им возможность вырасти до> 90% слияния. (Это занимает от 2 дней) Аспирируйте питательной среды и, в до-регулировать E-селектина выражения, добавьте свежую среду с 50ng/mL ИЛ-1β в течение 4-6 часов. Сотовые монослоев теперь готовы для прокатки теста. Чтобы заблокировать E-селектина функции, нейтрализующих анти-человеческий E-селектина Моава (клон BBIG-E4 (5D11)) могут быть добавлены в 20μg/ml для ~ 1 час при температуре 37 ° C. 2. Подготовка по правам гемопоэтических предшественников KG1a Клетки для потока палаты Гемопоэтических клеток человека KG1a предшественников выращивают до слияния (1х10 6 кл / мл) в RPMI-1640 с глютамином и 10% ЭТС / 1% пенициллина стрептомицин и пипеткой прямо из колбы для использования в потоке анализа камеры. Сотовые количество рассчитывается hemacytometer а затем клетки ресуспендировали в 1 х 10 6 клеток / мл в HBSS 10 мМ HEPES (H / H буфера) и 2 мМ CaCl 2 Клетки хранятся на льду до использования в анализе. 3. Подготовка Микроскоп, плоского палаты потока и шприцевой насос (рис. 1) Рисунок 1. Иллюстрация плоского Анализ палаты Flow. Инвертированный микроскоп, Гарвардский шприцевой насос, компьютер / камеры и плоского потока камеры помещаются в оптимальное расположение для эффективного и воспроизводимого клеточного анализа. Включите питание и источником света для инвертированного микроскопа и власть шприцевой насос и выберите 10X Цель на микроскопе. Место 50 мл коническую трубку в держатель и залейте H / H и 2 мМ CaCl 2. Место 5 мл пластиковые пробирки в пробирку, держатель ниже 50 мл коническую трубку Место 60 мл шприца в шприцевой насос (Не забудьте, что оба поршня и тела шприц оба обеспеченных). Прикрепить 3-полосная стоп-кран до конца 60 мл шприц и присоедините шприц 5 мл 3-полосная стоп-кран. Место Параллельные аппарата палаты Flow (GlycoTech, Inc) на столике микроскопа с входной лампы вправо, выходной лампы на левую и вакуумную трубку к спине. Присоединить вакуумный шланг к вакуумной и открытой воздушный клапан, чтобы параллельно пластине аппарата присоединиться к сцене. (Это проверяет, является ли вакуум юбка на поток камера герметично.) Выключите воздушный клапан. Присоединить выходной трубкой линии (слева микроскопа) для 3-полосная стоп-кран. Аппарат в настоящее время подготовлен для размещения на HBMEC-60 монослоя пластины. Место HBMEC-60 пластины монослоя и положите на центр микроскопом. Включите вакуумный и положение аппарата проточную камеру над плитой, что монослой пластина в центре. Осторожно опустите аппарат проточную камеру на HBMEC-60 монослоя пластины и позволяют аппарата поток камеры всасывания вниз. (Там должно быть никаких звуков воздух побега и в этот момент вам может понадобиться, чтобы оказать давление на камеру, чтобы сжать резиновую прокладку.) После вакуумной было установлено, трубка место входа (справа) в 50 мл коническую трубку с H / H с 2 мМ CaCl 2. Открытие 3-полосная стоп-кран, чтобы поступать в 60 мл шприц и поместите насос в "насосном режиме". Для удаления воздуха из входных / выходных линий, не поднимая клеток на пластину, используйте шприцевой насос установлен на уровне 2mL/minute заполнить потребления труб, а затем быстро установить до 0,5 мл / мин непосредственно перед жидкости достигает аппарата. Крайне важно, чтобы премьер этого создана тщательно и избежать воздушных пузырьков, снимет монослоя от пластинки. Как только жидкость видел переехать в 60 мл шприц, проточную камеру и шприцевой насос быть инициирован и потока камера готова к работе. Это создали будет повторяться для каждого запуска вход клеток и для каждой новой пластинкой необходимо. 4. Захват лейкоцитов Роллинг События использованием NIS элементов Открытое NIS элементов на рабочем столе. Нажмите кнопку "играть" значок для живого изображения. Автоматическая экспозиция позволит вам увидеть пластины легче сейчас, и очень важно для фокусировки. Будьте уверены, что микроскоп фокусируется на клеточный монослой. Как только внимание, повторно устанавливать экспозицию с 1 кадр / сек и отрегулируйте свет на микроскоп. Изображение должно появиться на компьютере и не будут видны в микроскоп видоискатель из-за низкого уровня освещенности. Свет гистограмма может быть объявлениеотрегулирована, чтобы удалить фон экспозиции или улучшить сотовые ясности. Нажмите на 2X2 бен или Живой бен получить картину, которая идеально подходит для видеосъемки Нажмите на кнопку "Макрос" в строке меню и выберите "писать в порт", выбрать порт "COM3", и "открыть". (Это открывает порт координировать свои действия с шприцевой насос. Внесите 1 мл клеточной суспензии KG1a в 5 мл пробирке вблизи линии трубы ввода, а затем место линейный вход трубы на дно пробирки. Переход к строке меню, нажмите на кнопку "Capture", "замедленная приобретения". Новое меню появится. Выберите протокол прочного 210 секунд, это длина программы для прокатки на HBMEC-60 ячейки. (Каждая фаза запрограммирован, чтобы сделать снимок каждую секунду в течение всего срока насос протокол. Он также настроен на отправку команды через порт COM3, чтобы начать насоса.) Если покадровой прерывается, насос не остановит сам по себе и должны быть сброшены. Нажмите Отмена, чтобы вернуться и жить изображения. Установить шприцевой насос, чтобы "режим программирования", согласно инструкции по эксплуатации. (Программа режим позволяет для ручного программирования специфических ставок потока (т.е. уровни напряжения сдвига), чтобы быть передана в камере и диктовать взаимодействия KG1a клетка за HBMEC-60 клеточный монослой.) Настройки KG1a ячейки прокатки на hBMEC Клетки были следующими 4,2 дин / см 2 в течение 45 с, 0,3 дин / см 2 в течение 60 с, а ступенчато увеличивается каждые 15 с до максимум 4,2 дин / см 2 Стена напряжения сдвига (W-й) в камере рассчитывается по следующей формуле: W = й 6μQ / 2 б, где μ это расчетная вязкость среды (0,0076 P), Q является объемный расход в мл / с, это канал, высота (толщину прокладки) в см (0,03 см), и б это ширина канала в см (0,5 см). Расход регулировались с помощью программы режиме шприцевой насос. Микроскоп и компьютер готов к захвата замедленной киносъемки. Нажмите кнопку "начать работать" на компьютер, чтобы начать сбор данных. Во время работы программы, не забудьте добавить СМИ пробирку KG1a клетки для того, чтобы держать ввода / вывода трубки полного среднего (Убедитесь Есть нет воздушных пузырей). 5. Зависимость Sialylation терминала и поверхностного гликопротеина Е-селектина-опосредованной KG1a Сотовые 5. Холмистый рельеф (рис. 2; Видео Клипы 5.1-5.5) Опробование в KG1a ячейки прокатки на не стимулировали HBMEC-60 клеток. (Отрицательный контроль) KG1a клетки были подготовлены и вливаются в поток горницу над живое, без ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше. Опробование клеточных KG1a прокатки на HBMEC-60 клеток, предварительно обработанных ИЛ-1β. (E-селектина зависимость контроль) KG1a клетки были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше. Опробование клеточных KG1a прокатки на HBMEC-60 клеток, предварительно обработанных ИЛ-1β, а затем нейтрализации анти-человеческий E-селектина Моава. (E-селектина зависимость контроль) KG1a клетки были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить Ил- 1β-стимулированных HBMEC-60, предварительно обработанных нейтрализующих анти-человеческий E-селектина Моава, как описано выше. Опробование в сиалидазы-переваренной KG1a ячейки прокатки на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60. KG1a клетки, предварительно обработанных 0.1U/ml холерный вибрион нейраминидазы для 1 час при 37 ° С были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше. Опробование протеазы-переваренной KG1a ячейки прокатки на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60. KG1a клетки, предварительно обработанных протеазы, 0.2U/ml Бромелайн за 1 час при 37 ° С, были подготовлены и вливаются в поток горницу над жить ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60, как описано выше. 6. Анализ NIS-Elements-Захваченные KG1a Графические элементы и клеточной KG1a Роллинг данных После временной последовательности приобретается, сохраните данные. Перейти в "меру" на вкладке меню и выберите пункт "определить порог". Перемещение баров, так что нужные ячейки окрашены в красный цвет. Выберите "все изображения", затем "Хорошо". Весь покадровой последовательности должны теперь быть изменены с помощью видимого красного подвижного клеток. К "Мера" и выберите "ограничения". (Ограничения позволяют пользователю исключить thresholded объектов, которые не представляют подвижного клеток. Это, прежде всего фона, созданного HBMEC-60 монослоя.) Выберите "площадь" и минимального входного и максимальные значения для области, для прокатки клеток. Повторите этот шаг для «удлинения» и «округлость». Выберите "мера" и выберите "создать двоичный использованием ограничений", и установить ограничение значений для оптимизации NIS-Elements система распознавания подвижного клеток на монослой HBMEC-60 клеток. Возвращаемся к "меры", выберите "поле данных", а затем выберите "перезагрузки данных". Закрыть меню. Вернуться в "Мера" и ГПlect "сканирования поля". Открытые "Мера", "Полевые данные", выберите "номер или объектов", а затем выберите "все поля" и экспортировать данные в Microsoft Excel. Выберите "Очистить данные" для подготовки NIS-Elements ячейки приобретение для следующего сбора данных. Результаты: Рисунок 3. Плоского потока палатой анализа E-селектина-связывающей активности на клетках KG1a. KG1a клетках, обработанных сиалидазы или протеазы, были проанализированы для прокатки эффективность на монослоев HBMEC-60 клеток, предварительно обработанных ИЛ-1β. Отрицательный контроль подвижного эксперименты были проведены на основе анализа KG1a ячейки прокатки на не-ИЛ-1β-стимулированных HBMEC -60 клеток или на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60 клеток, обработанных нейтрализующих анти-человеческий E-селектина Моава (5D11). Частоты сотовый подвижного проводились в трех экземплярах и проанализированы с NIS-Elements программное обеспечение. (* Статистическая значимость, р <0,001) В этом видео-отчет, мы предоставили визуальной информации о том, как анализировать лейкоцитов – эндотелиальных взаимодействий клеток в физиологических условиях сдвига стресс. В частности, мы проанализировали роль Е-селектина – E-селектина лигандов в посредничестве лейкоцитов привязывать и прокат, клей поведение необходимых для совершения вторичной более стабильной обязательных мероприятий на основе таких рецепторов, как интегрины и гиалуронана рецепторов. Использование плоского потока камера адаптирована для использования с инвертированным микроскопом, Гарвардский шприцевой насос, видеокамера и компьютер / клетка приобретение оборудования, мы провели эксперименты котором E-селектина лиганд + KG1a клетки были использованы в качестве наших лейкоцитов модели и hBMEC клеток (HBMEC- 60) стимулировали провоспалительных цитокинов IL-1β, были использованы как наш E-селектина + человеческих эндотелиальных модели клетки (1-6). Как сообщалось ранее, мы наблюдали надежная клетка KG1a прокатки на ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60 клеток в диапазоне сдвига уровня напряжения в E-селектина-зависимым образом (рис. 3) (Статистически значимых различий по сравнению с KG1a ячейки прокатки на не-ИЛ-1β стимулировали HBMEC-60 клеток). Отрицательный контроль, который состоял из KG1a ячейки прокатки на не-ИЛ-1β-стимулированных HBMEC-60 клеток или на ИЛ-1β-стимулированных HBEMC-60 клеток, предварительно обработанных анти-человеческий E-селектина МАБ, проводились параллельно, чтобы продемонстрировать зависимость стимуляции цитокинов и E-селектина выражение для прокатки активности (рис. 3). Кроме того, прокат анализа клеток, предварительно обработанных KG1a холерный вибрион нейраминидазы (сиалидазы) или с бромелайн, неспецифические протеазы известно для переваривания поверхности Е-селектина гликопротеинов лиганд, подчеркнул важность терминал остатков сиаловой кислоты и поверхностных гликопротеинов для E-селектина лиганд деятельности (2,3).