Analyse van de Fysiologische E-selectine-Mediated Leukocyte Rolling op microvasculaire endotheel
Summary
Dit rapport geeft een visuele voorstelling van de parallelle plaat stroom kamer analyse voor het bestuderen van leukocyten endotheliale interacties onder fysiologische shear stress. Deze methode is vooral nuttig voor het onderzoeken van de rol van het endotheel (E)-selectine en leukocyten E-selectine liganden die leiden tot leukocyten rollen op de endotheliale cellen oppervlakken.
Abstract
E-selectine is een type-1 membraaneiwit op microvasculaire endotheelcellen die helpt te starten werving van circulerende leukocyten aan huid-, bot-en ontstoken weefsels. E-selectine expressie is constitutief op de huid en bot microvaten en is induceerbaar door pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1α / en TNF-α, op bloedvaten in ontstoken weefsels. Dit lectine receptor bemiddelt zwakke binding interacties met koolhydraten contra-receptor liganden op circulerende leukocyten, wat resulteert in een karakteristieke rollende gedrag. Omdat deze interacties vooraf meer stabiele lijm evenementen en diapedesis activiteit, karakterisering van leukocyten rollen activiteit en identificatie van leukocyten E-selectine liganden zijn belangrijke doelstellingen in studies van leukocyt mensenhandel en ontstekingen en de ontwikkeling van anti-inflammatoire geneesmiddelen (1-5) . De bedoeling van dit rapport is om een visuele, uitgebreide beschrijving van de meest gebruikte technologie voor het bestuderen van E-selectine E-selectine ligand interacties onder fysiologische doorbloeding voorwaarden. Ons laboratorium in samenwerking met de Harvard Skin Disease Research Center maakt gebruik van een state-of-the-art parallelle plaat stroom kamer apparaat, vergezeld van digitale visualisatie en nieuwe opname software, NIS-elementen. Deze technologie stelt ons in staat om de hechting gebeurtenissen te analyseren in real time voor het scherm visualisatie en opname rollen activiteit in een video-formaat. Celadhesie parameters, zoals walsen frequentie, schuifweerstand en binding / tethering-efficiëntie, worden berekend op basis van NIS-Elements-software, geëxporteerd naar een Excel-spreadsheet en onderworpen aan statistische analyse. In de demonstratie hier gepresenteerde, hebben we in dienst van de parallelle plaat stroom kamer naar E-selectine-afhankelijke leukocyten rollen activiteit te onderzoeken op levende menselijke beenmerg endotheelcellen (hBMEC). Humane hematopoietische voorlopercellen KG1a cellen, die een hoog niveau van E-selectine ligand uit te drukken, werden gebruikt als onze leukocyten model, terwijl een onsterfelijk hBMEC cellijn, HBMEC-60 cellen, werd gebruikt als onze endotheelcellen model (6). Te induceren en native E-selectine expressie te simuleren in de stroom kamer, HBMEC-60 cellen werden voor het eerst geactiveerd met IL-1. Onze video presentatie liet zien dat parallelle plaat flow analyse is een geschikte methode voor het bestuderen van fysiologische E-selectine-gemedieerde leukocyten rollen activiteiten en dat functionele karakterisering van leukocyten E-selectine ligand (s) in de stroom kamer kan worden vastgesteld door de uitvoering van protease of glycosidase ontsluitingen.
Protocol
Discussion
Parallelle plaat stroom kamer-analyse is een gespecialiseerd in-vitro-assay systeem gebruikt voor het bestuderen van leukocyten – endotheliale lijm interacties onder schuifspanning soortgelijke voorwaarden als die bijgebracht op het oppervlak van een post-capillaire venule. Zoals hier in onze visuele presentatie afgebeeld, tonen we de waarde van dit systeem voor het onderzoeken van de rol van E-selectine – E-selectine liganden in het bemiddelen van leukocyten tethering en rollen op het oppervlak van geactiveerde microvasculaire endotheel. We laten ook de toepassing van de protease, glycosidase en blokkerend antilichaam behandelingen voor het ophelderen van de rol van E-selectine en zijn liganden in dit systeem. Deze analyses zijn zeer reproduceerbaar en helpen vormen een experimentele basis voor het bestuderen van E-selectine – E-selectine ligand-functie in vivo.
Naast het bestuderen van cel adhesie met monolagen van cytokine-geactiveerde microvasculaire endotheelcellen (hBMEC of menselijke navelstreng of dermale microvasculaire endotheelcellen), kunnen testen worden uitgevoerd met behulp van gezuiverd recombinant humaan E-selectine of E-selectine-Ig chimère moleculen als een substraat voor celadhesie. Andere adhesieve interacties gemedieerd door leukocyten (L-)-selectine en bloedplaatjes (P)-selectine kunnen ook worden getest met behulp van parallelle plaat stroom kamer-technologie. Door te variëren met het type cel monolaag / eiwit substraat of van input leukocyten / selectine-transfectant cel modellen, onderzoekers kan de rol van deze interacties te bestuderen onder fysiologische shear stress omstandigheden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering voor dit project werd verstrekt door een American Cancer Society Research Scholar Award, (06-024-01-CSM naar Charles J. Dimitroff), een National Institutes of Health / National Cancer Institute te verlenen (RO1CA118124 Charles J. Dimitroff), en een National Institutes of Health / Nationaal Instituut van artritis en spier-en huidziekten te verlenen (P30 AR042689 aan Dr Thomas S. Kupper, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FBS | SIGMA | F6178-500ML | ||
| DPBS | GIBCO | 14190 | ||
| 0.5 M EDTA | GIBCO | 15575-038 | ||
| 1M HEPES | GIBCO | 15630 | ||
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | ||
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | ||
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD FALCON | 353001 | ||
| Fibronectin , from human plasma | SIGMA | 86088-83-7 F2006-2MG | ||
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | SIGMA | I9401-5UG | ||
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO | 14170 | ||
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | ||
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | ||
| Heparin | Abraxis Pharmaceutical Products | 504011 | ||
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | ||
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | ||
| Plastic Test tubes | BD Bioscience | 352008 | ||
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | ||
| Bromelain | SIGMA | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).
