Mikrovasküler Endotel Fizyolojik E-selektin aracılığı ile Lökosit Rolling Analizi
Summary
Bu rapor, görsel bir tasviri lökosit leşimlerini kayma fizyolojik stres altında çalışmak için paralel plaka akış segment analizi sağlar. Bu yöntem, tetik lökosit endotel hücre yüzeyleri üzerinde yuvarlanan E-selektin, endotel (E)-selektin ve lökosit ligandlar rolünü araştırmak için özellikle yararlıdır.
Abstract
E-selektin, lökosit kutanöz, kemik ve iltihaplı dokulara dolaşan işe başlatmak yardımcı mikrovasküler endotel hücreleri üzerinde bir tip-1 membran protein. E-selektin ekspresyonu, deri ve kemik mikrodamarlar kurucu ve iltihaplı dokularda / IL-1α ve TNF-α, mikrodamarlar gibi pro-inflamatuar sitokinler, indüklenebilir. Bu lektin reseptör aracılık, karakteristik bir haddeleme davranış sonucu dolaşan lökositlerin, karbonhidrat karşı reseptör ligandlar ile zayıf bağlayıcı etkileşimleri. Çünkü bu etkileşimlerin daha istikrarlı bir yapışkan olaylar ve diapedesis aktivite, lökosit yuvarlanma faaliyet karakterizasyonu ve E-selektin, lökosit ligand belirlenmesi öncesinde, lökosit kaçakçılığı ve inflamasyon çalışmaları ve anti-inflamatuar terapötikler geliştirme (1-5) büyük hedefler var . Bu raporun amacı, E-selektin, E-selektin ligand etkileşimleri fizyolojik kan akışını koşullar altında çalışmak için en yaygın olarak kullanılan teknoloji görsel, kapsamlı bir tanım vermektir. Harvard Cilt Hastalıkları Araştırma Merkezi ile birlikte laboratuar dijital görselleştirme ve yeni kayıt yazılımı, NIS-Elements eşliğinde bir devlet-the-art paralel plaka akış odasına aparat kullanır. Bu teknoloji gerçek zamanlı olarak ekranda görselleştirme yanı sıra bir video formatında kayıt haddeleme aktivite için yapışma olayları analiz etmek için izin verir. Frekans, kayma direnci haddeleme ve bağlayıcı / tethering verimliliği gibi hücre adezyon parametreleri, bir Excel elektronik tablo ihraç ve istatistiksel analize tabi, NIS-Elements yazılımı ile hesaplanır. Burada sunulan gösteri, paralel plaka akış odası, canlı, insan kemik iliği endotel hücreleri (hBMEC) bağımlı E-selektin, lökosit yuvarlanma faaliyet araştırmak için kullandı. Ölümsüzleştirdi hBMEC hücre hattı HBMEC-60 hücreleri, endotel hücre modeli (6) olarak kullanılır iken, E-selektin ligand yüksek düzeyde bir ifade hematopoetik progenitör İnsan KG1a hücreler, bizim lökosit model olarak kullanılmıştır. Akış odasında, doğal E-selektin ekspresyonu neden ve simüle HBMEC-60 hücrelerinde IL-1 ile aktive edildi. Bizim video sunumu paralel plaka akış analizi proteaz veya glycosidase uygulamak suretiyle tespit edilebilir akış odasında fizyolojik E-selektin aracılı lökosit yuvarlanma faaliyetleri ve lökosit E-selektin ligand (lar) bu fonksiyonel karakterizasyonu eğitimi için uygun bir yöntem gösterdi sindirimler.
Protocol
Discussion
Paralel plakalı akış segment analizi lökosit eğitim için kullanılan in vitro test sisteminde özel bir benzer kayma gerilmesi koşulları altında endotel yapışkanlı etkileşimleri bir post-kapiller venule yüzeyinde aktarılmamaktadır. E-selektin, lökosit tethering aracılık ve aktif mikrovasküler endotel yüzey üzerinde yuvarlanan ligandlar – burada bizim görsel sunum tasvir, E-selektin rolünü araştırmak için bu sistemin değerini göstermek. Ayrıca, proteaz, glycosidase ve bu sistem içinde E-selektin ve ligandlar rol nedenlerine açıklık için engelleme antikor tedavileri uygulamanın ortaya koymaktadır. Bu analizler son derece tekrarlanabilir ve E-selektin eğitim için deneysel bir temelini oluşturan yardımcı in vivo olarak E-selektin ligand fonksiyonu.
Sitokin aktive mikrovasküler endotel hücreleri (hBMEC veya insan umbilikal ven veya dermal mikrovasküler endotel hücreleri) mono tabakaları ile hücre adezyon okuyan yanı sıra, yazı bir substrat olarak rekombinant E-selektin, insan ya da arıtılmış E-selektin-Ig kimerik molekülleri kullanılarak yapılabilir hücre adezyon. Diğer yapıştırıcı etkileşimleri aracılığıyla lökosit (P) (L)-selektin ve trombosit-selektin de paralel plakalı akış odasına teknolojisi kullanılarak test edilmelidir. Tip hücre tek tabaka / protein substrat değiştirerek ya da giriş lökosit / selektin transfectant hücre modelleri, araştırmacılar, fizyolojik kayma gerilmesi koşullar altında bu etkileşimlerin rolü eğitim görebilirsiniz.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü hibe (Charles J. Dimitroff RO1CA118124) Ulusal Sağlık Enstitüleri; bir Amerikan Kanser Derneği Araştırmacı Ödülü, (Charles J. Dimitroff 06-024-01-CSM) tarafından bu proje için finansman sağlanmıştır ve Sağlık / National Institute Artrit ve Kas-iskelet ve Cilt Hastalıkları hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri (P30 AR042689 Dr. Thomas S. Kupper, Brigham ve Kadın Hastanesi, Boston, MA).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FBS | SIGMA | F6178-500ML | ||
| DPBS | GIBCO | 14190 | ||
| 0.5 M EDTA | GIBCO | 15575-038 | ||
| 1M HEPES | GIBCO | 15630 | ||
| Parallel-Plate Flow Chamber Kit | GlycoTech | 31-001 | ||
| PHD2000 Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | ||
| 35x10mm Tissue Culture Dish | BD FALCON | 353001 | ||
| Fibronectin , from human plasma | SIGMA | 86088-83-7 F2006-2MG | ||
| Interleukin-1_, Human; Recombinant | SIGMA | I9401-5UG | ||
| HBSS (Hank s Buffered Saline Solution) | GIBCO | 14170 | ||
| Medium 199 w/ HEPES & Glutamine | Invitrogen | 12320-039 | ||
| Human Serum | Innovative Research, Inc. | IPLA-SER1 | ||
| Heparin | Abraxis Pharmaceutical Products | 504011 | ||
| Recombinant human fibroblast growth factor | R&D Systems | 233-FB | ||
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 | ||
| Plastic Test tubes | BD Bioscience | 352008 | ||
| Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11) | R&D Systems | BBA16 | ||
| Bromelain | SIGMA | B-4882 |
References
- Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen. J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .
- Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin. Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).
- Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells. Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).
- Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand. J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).
- Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis. J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).
- Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines. Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).
