تحليل فسلجي المتداول كريات بيضاء E - Selectin بوساطة بطانة الاوعية الدموية الدقيقة في

1. إعداد hBMEC (HBMEC – 60 خلية) أحادي الطبقة على أطباق بتري لغرفة تدفق معطف 35 × 10MM الأنسجة ثقافة الأطباق مع 2ml من فبرونيكتين 20μg/ml (في برنامج تلفزيوني) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أو 37 درجة مئوية. نضح حل فبرونيكتين من الأطباق وإضافة 1.5 X10 – 60 5 HBMEC الخلايا [199 متوسطة مع HEPES والجلوتامين ، و 10 ٪ FBS ، مصل الإنسان 10 ٪ ، ووحدات / 5 مل الهيبارين ، 1ng/ml المؤتلف نمو الخلايا الليفية الإنسان عاملا ، 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين] إلى الطبق ، والسماح لها أن تنمو لالتقاء> 90 ٪. (وهذا يأخذ 2 أيام) نضح نمو وسائل الإعلام ، وإلى ما يصل تنظيم E – selectin التعبير ، إضافة متوسطة جديدة مع 50ng/mL IL – 1β لمدة 4-6 ساعات. monolayers الخلية هي الآن جاهزة للمقايسة المتداول. لكتلة E – selectin الدالة ، وتحييد لمكافحة الإنسان E – selectin موآب يمكن إضافة (استنساخ BBIG – E4 (5D11)) في ل20μg/ml ~ 1hr عند 37 درجة مئوية. 2. إعداد الإنسان خلايا المكونة للدم KG1a السلف لغرفة تدفق تزرع الإنسان KG1a السلف الخلايا المكونة للدم confluency (1×10 6 خلية / مل) في RPMI – 1640 مع الجلوتامين و 10 ٪ FBS / 1 ٪ البنسلين والستربتوميسين وpipetted مباشرة من القارورة لاستخدامها في غرفة فحص التدفق. ويتم احتساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ومن ثم يتم إعادة تعليق الخلايا في الخلايا 1 × 6 10 / مل في HBSS مع HEPES 10MM (H / H العازلة) و2mm وCaCl 2 يتم تخزين الخلايا على الجليد حتى استخدامها في فحص. 3. الإعداد لهذه الدائرة مجهر التدفق الموازي لوحة ومضخة الحقنة (الشكل 1) الشكل 1. رسم توضيحي لواز بلايت تدفق تحليل الدائرة. توضع مجهر مقلوب ، هارفارد مضخة الحقنة ، الحاسوب الكاميرا / والموازية لوحة غرفة تدفق في الترتيب الأمثل للتحليل الخلية فعالة وقابلة للتكرار. بدوره على السلطة ومصدر الضوء إلى مجهر مقلوب والقدرة على ضخ المحاقن وحدد الهدف 10X على المجهر. مكان 50mL المخروطية في أنبوب حامل وملء مع H / H و2mm وCaCl 2. مكان اختبار البلاستيك 5ml حامل الأنابيب في أنبوب اختبار تحت أنبوب 50mL المخروطية 60mL مكان الحقنة في مضخة الحقنة (تأكد أن كلا من المكبس والجسم على حد سواء من حقنة المضمون). نعلق 3 في اتجاه وقف الديك حتى نهاية 60mL حقنة حقنة ونعلق 5mL إلى 3 في اتجاه والديك توقف. المكان قاعة تدفق الموازية جهاز (GlycoTech ، وشركة) على خشبة المسرح مع المجهر أنبوب الإدخال إلى اليمين ، أنبوب الإخراج إلى اليسار وفراغ أنبوب إلى الخلف. نعلق على أنابيب فراغ الفراغ وفتح صمام الهواء للسماح أجهزة موازية لوحة التمسك المرحلة. (هذا إذا كانت التجارب تنورة على فراغ الغرفة تدفق الهواء غير محكم.) إيقاف صمام الهواء. نعلق خط أنابيب الانتاج (على يسار المجهر) إلى 3 في اتجاه وقف الديك. مستعدة الآن لوضع الجهاز على لوحة المونولاير HBMEC – 60. لوحة مكان المونولاير HBMEC – 60 ووضعت على مركز المجهر. بدوره على فراغ ، وموقف الجهاز الغرفة تدفق فوق لوحة مثل هذه اللوحة المونولاير هو في الوسط. انخفاض بلطف جهاز الغرفة تدفق على لوحة المونولاير HBMEC – 60 ، والسماح بتدفق جهاز لشفط غرفة أسفل. (يجب أن تكون هناك أصوات الهواء الهرب وعند هذه النقطة قد تحتاج إلى ممارسة الضغط على غرفة لضغط المطاط طوقا). مرة واحدة وقد تم تأسيس فراغ ، ضع أنبوب الإدخال (على اليمين) في أنبوب 50mL مخروطي يحتوي على H / H مع 2mm وCaCl 2. 3 مفتوحة في اتجاه ووقف الديك للسماح بتدفق المحقنة 60mL ومضخة مكان في "وضع مضخة". لإزالة الهواء من الإدخال / الإخراج خطوط دون رفع الخلايا على لوحة ، واستخدام مضخة الحقنة التي وضعت في 2mL/minute لملء الأنبوب المدخول ، ثم المسارعة إلى 0.5 مل / دقيقة فقط قبل أن يصل السائل الجهاز. لا بد من اقامة رئيس الوزراء هذا بعناية وتجنب فقاعات الهواء التي سترفع أحادي الطبقة من اللوحة. وينظر مرة واحدة لنقل السوائل في حقنة 60ml ، وغرفة المضخات وتدفق الحقنة وقد تم تجهيزهم وغرفة للتدفق غير جاهزة للاستخدام. هذه المجموعة سوف تصل تتكرر لكل خلية تشغيل المدخلات ولكل لوحة الجديدة المطلوبة. 4. كريات بيضاء التقاط الأحداث المتداول به عناصر شيكل فتح عناصر شيكل على سطح المكتب. اضغط على "مسرحية" رمز لصورة حية. وسوف تعرض السيارات تسمح لك أن ترى لوحة أسهل الآن ، والمهم التركيز. تأكد من أن يتركز بشكل صحيح على المجهر المونولاير الخلية. ركز مرة واحدة ، وإعادة ضبط التعرض للضوء إطار / ثانية ، وضبط (1) بشأن المجهر. وينبغي أن تظهر الصورة على الكمبيوتر والتي لم تعد مرئية في عدسة الكاميرا المجهر بسبب مستوى الإضاءة الخافتة. يمكن أن يكون الضوء المدرج ثم الإعلانيةjusted التعرض لإزالة خلفية أو تحسين الوضوح الخلية. انقر على بن 2X2 أو بن لايف للحصول على الصورة التي هي مثالية لالتقاط فيلم انقر على "ماكرو" على شريط القوائم واختيار "الكتابة إلى المنفذ" ، واختيار المنفذ "COM3" ، و "فتح". (هذا يفتح منفذ للتنسيق مع مضخة الحقنة. ماصة 1mL التعليق KG1a الخلية في أنبوب اختبار 5ml بالقرب من خط أنابيب الإدخال ثم ضع خط أنابيب الإدخال إلى أسفل أنبوب الاختبار. انتقل إلى شريط القوائم ، انقر على "التقاط" ، "الوقت الفاصل بين شراء". وهناك قائمة جديدة يطفو على السطح. حدد البروتوكول 210 ثانية دائم ، وهذا هو طول برنامج المتداول على خلايا – 60 HBMEC. (مبرمجة كل مرحلة لالتقاط صورة كل ثانية لمدة البروتوكول المضخة. ومن المقرر أيضا أن يصل الأمر إلى إرسال من خلال منفذ COM3 لبدء تشغيل المضخة.) إذا انقطع مرور الزمن ، ومضخة لن تتوقف من تلقاء نفسه ، ويجب أن تكون إعادة تعيين. اضغط إلغاء للعودة للعيش الصورة. ضبط مضخة الحقنة الى "وضع برنامج" وفقا لدليل التعليمات. (وضع برنامج يسمح للبرمجة اليدوية للمعدلات تدفق محددة (أي مستويات إجهاد القص) ليتم الكشف عنها داخل الغرفة والتفاعلات الخلية KG1a تملي على المونولاير HBMEC – 60 خلية) ضبط خلية KG1a المتداول على خلايا hBMEC كانت على النحو التالي 4.2 dynes / سم 2 لمدة 45 ثانية ، dynes 0.3 / سم 2 لمدة 60 ثانية ، والزيادات التدريجية كل 15 ق إلى حد أقصى قدره 4.2 dynes / سم 2 وقد حسبت جدار القص الاجهاد (W ش) في غرفة وفقا للمعادلة التالية : W = 6μQ ش / أ ، ب 2 ، حيث μ هي اللزوجة تقدر وسائل الإعلام (0.0076) ف ، س هو معدل التدفق الحجمي في مل / ق ، وهو هو ارتفاع قناة (طوقا سمك) في الطول (0.03 سم) ، و (ب) هو عرض القناة في الطول (0.5 سم). تم تنظيم معدلات التدفق باستخدام وضع برنامج للمضخة الحقنة. المجهر والكمبيوتر الآن على استعداد لالتقاط الوقت الفاصل بين التصوير الفوتوغرافي. اضغط على "بدء تشغيل" على جهاز الكمبيوتر لبدء الحصول على البيانات. أثناء تشغيل البرنامج ، ومن المؤكد أن وسائل الإعلام إضافة إلى أنبوب اختبار يحتوي على خلايا KG1a من أجل الحفاظ على أنابيب الإدخال / الإخراج الكامل المتوسطة (تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء). 5. اعتماد Sialylation الطرفية وجلايكوبروتين السطحية للخلية KG1a E – selectin بوساطة 5. المتداول (الشكل 2 ؛ فيديو كليب من 5،1-5،5) يعاير من الخلايا KG1a المتداول على عدم تحفيز الخلايا HBMEC – 60 (الرقابة السلبية) وأعدت خلايا KG1a وحقنها في غرفة تدفق أكثر من العيش غير IL – 1β – حفز HBMEC – 60 كما هو موضح أعلاه. يعاير من الخلايا KG1a المتداول على خلايا – 60 HBMEC قبل تعامل مع IL – 1β (E – selectin الاعتماد التحكم) وأعدت خلايا KG1a وحقنها في غرفة تدفق أكثر من العيش IL – 1β – حفز HBMEC – 60 كما هو موضح أعلاه. يعاير من الخلايا KG1a المتداول على خلايا – 60 HBMEC قبل تعامل مع IL – 1β وتحييد ثم مكافحة الإنسان E – selectin موآب. (E – selectin الاعتماد التحكم) وأعدت خلايا KG1a وحقنها في غرفة تدفق أكثر من العيش IL – 1β – حفز HBMEC – 60 سابقة التجهيز مع تحييد لمكافحة الإنسان E – selectin موآب على النحو المبين أعلاه. يعاير من سياليداز هضم الخلية KG1a المتداول على 1β – IL – حفز HBMEC – 60. وأعدت خلايا KG1a سابقة التجهيز مع 0.1U/ml الضمة الكوليرية النورامينيداز ل1hr عند 37 درجة مئوية ، وحقنها في غرفة تدفق أكثر من العيش IL – 1β – حفز HBMEC – 60 كما هو موضح أعلاه. يعاير من البروتياز هضم الخلية KG1a المتداول على 1β – IL – حفز HBMEC – 60. خلايا KG1a سابقة التجهيز مع البروتيني ، وأعدت ل1hr 0.2U/ml بروميلين في 37 درجة مئوية ، وحقنها في غرفة تدفق أكثر من العيش IL – 1β – حفز HBMEC – 60 كما هو موضح أعلاه. 6. تحليل عناصر شيكل ، التي تم الاستيلاء عليها خلايا KG1a البيانات والرسوم البيانية للخلية KG1a رولينج بعد الحصول التسلسل الزمني ، حفظ البيانات. انتقل إلى علامة التبويب "تدبير" على شريط القوائم واختيار "تحديد العتبة". نقل القضبان بحيث يتم الخلايا الملونة باللون الأحمر المرجوة. حدد "كافة الصور" ثم "حسنا". وينبغي الآن كامل الوقت الفاصل بين تسلسل يمكن تعديلها مع خلايا الدم الحمراء مرئية المتداول. انتقل إلى "القياس" وحدد "القيود". (قيود تسمح للمستخدم لاستبعاد الكائنات thresholded لا تمثل الخلايا المتداول ، وهذا هو في المقام الأول الخلفية التي أوجدتها المونولاير HBMEC – 60.) حدد "المنطقة" والمدخلات وقيم دقيقة كحد أقصى للمنطقة لخلايا المتداول. كرر هذه الخطوة من أجل "الاستطالة" و "استدارة". حدد "التدبير" وحدد "إنشاء ثنائي باستخدام القيود" ، وتعيين قيم لتحسين تقييد شيكل ، عناصر برنامج التعرف على الخلايا المتداول أحادي الطبقة من الخلايا HBMEC – 60. نعود الى "تدبير" ، حدد "حقل البيانات" ، ثم حدد "إعادة تعيين البيانات". إغلاق هذه القائمة. العودة إلى "القياس" وحد ذاتهاlect "مسح الميداني". فتح "القياس" ، "حقل البيانات" ، حدد "رقم أو كائنات" ، ثم حدد "كافة الحقول" ، وتصدير البيانات إلى Microsoft Excel. حدد "بيانات واضحة" لتحضير عناصر شيكل ، اقتناء خلية لجمع البيانات المقبل. النتائج : الشكل 3. الموازي لوحة التحليل غرفة تدفق E – selectin الملزمة على نشاط خلايا KG1a. وقد تم تحليل الخلايا KG1a تعامل مع سياليداز أو البروتيني لالمتداول على كفاءة الخلايا monolayers – 60 HBMEC قبل تعامل مع IL – 1β. كما أجريت تجارب السيطرة السلبية المتداول عن طريق تحليل الخلايا KG1a المتداول على غير IL – 1β – حفز خلايا -60 HBMEC أو على 1β – IL – حفز خلايا HBMEC – 60 تعامل مع تحييد لمكافحة الإنسان E – selectin موآب (5D11). أجريت الترددات المتداول خلية في ثلاث نسخ وتحليلها مع شيكل ، عناصر البرنامج. (* دلالة إحصائية ، P <0.001) في هذا التقرير القائم على الفيديو ، قدمنا ​​التصوير البصري لكيفية تحليل الكريات البيض — التفاعلات الخلية البطانية تحت ظروف الإجهاد الفسيولوجية القص. على وجه الخصوص ، قمنا بتحليل دور E – selectin — E – selectin يغاندس في التوسط الربط الكريات البيض والمتداول ، وهو سلوك لاصقة اللازمة للالتزام الأنشطة الثانوية ملزمة أكثر استقرارا من خلال المستقبلات ، مثل لل integrins ومستقبلات hyaluronan. باستخدام غرفة تدفق موازية لوحة تكييفها للاستخدام مع مجهر مقلوب ، هارفارد مضخة الحقنة ، وكاميرا الفيديو والكمبيوتر / خلية الأجهزة حيازة وأجرينا التجارب حيث E – selectin يجند + استخدمت خلايا KG1a كنموذج لدينا الكريات البيضاء وخلايا hBMEC (HBMEC – واستخدمت 60) حفز مع الموالية للالتهابات خلوى ، IL – 1β ، كما لدينا + E – selectin الإنسان نموذج الخلية البطانية (1-6). كما ذكرت سابقا ، لاحظنا قوية KG1a الخلية المتداول على 1β – IL – حفز خلايا HBMEC – 60 على طائفة من مستويات التوتر القص بطريقة E – selectin التي تعتمد على (الشكل 3) (فروق ذات دلالة إحصائية عند مقارنتها مع الخلايا المتداول على KG1a غير IL – 1β HBMEC – 60 حفز الخلايا). السلبية الضوابط ، التي تتألف من خلية KG1a المتداول على غير IL – 1β – حفز خلايا HBMEC – 60 أو على 1β – IL – حفز كانت HBEMC – 60 خلايا سابقة التجهيز مع خريطة موقع لمكافحة البريد selectin الإنسان ، يقوم في الوقت ذاته لإثبات الاعتماد من التحفيز والتعبير خلوى E – selectin للنشاط المتداول (الشكل 3). وعلاوة على ذلك ، والتحليل المتداول من الخلايا KG1a سابقة التجهيز مع الضمة الكوليرية النورامينيداز مظللة (سياليداز) أو مع بروميلين ، وهو الأنزيم البروتيني غير محددة معروفة لهضم سطح يجند E – selectin بروتين سكري ، على أهمية مخلفات محطة الحامض اللعابي وبروتين سكري السطح ليجند – E selectin النشاط (2،3).