Analyse des leucocytes roulant physiologique E-sélectine-Mediated sur l'endothélium microvasculaire

1. Préparation de HBMEC (HBMEC-60 Cell) monocouche sur boîtes de Pétri pour la Chambre de débit Manteau 35 x 10mm de culture de tissus plats avec 2ml de la fibronectine 20μg/ml (dans du PBS) pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 3 heures à 37 ° C. Aspirer solution de fibronectine de plats et ajoutez 1,5 x10 5 cellules HBMEC-60 [Moyenne 199 avec HEPES & glutamine, 10% de FBS, 10% de sérum humain, 5 unités / ml d'héparine, 1ng/ml facteur humain recombinant de croissance des fibroblastes, 1% de pénicilline- La streptomycine] pour le plat et leur permettre de croître jusqu'à la confluence> 90%. (Cela prend 2 jours) Aspirer les milieux de croissance et, pour mettre à réguler l'expression de sélectine E, ajouter milieu frais avec de l'IL-1β 50ng/mL pour 4-6 heures. Monocouches de cellules sont maintenant prêts à rouler dosage. Pour bloquer la fonction E-sélectine, neutralisants anti-humain E-sélectine Moab (clone BBiG-E4 (5D11)) peuvent être ajoutés à 20μg/ml pour ~ 1h à 37 ° C. 2. Préparation des cellules hématopoïétiques humaines KG1a progénitrices des Chambre de circulation Homme cellules hématopoïétiques progénitrices KG1a sont cultivés jusqu'à la confluence (1×10 6 cellules / ml) dans du RPMI-1640 avec la glutamine et 10% de FBS / 1% de pénicilline-streptomycine et sont pipetés directement à partir du flacon pour une utilisation dans le dosage chambre d'écoulement. Le nombre de cellules est calculé en utilisant un hématimètre puis les cellules sont remises en suspension à 1 x 10 6 cellules / ml dans du HBSS avec 10mm HEPES (H / H Tampon) et 2mm CaCl 2 Les cellules sont stockées sur la glace jusqu'à utilisation dans le dosage. 3. Préparation du microscope, Chambre de circulation à plaques parallèles et pompe seringue (Figure 1) Figure 1. Illustration de plaques parallèles Analyse Chambre de circulation. Microscope inversé, Harvard seringue pompe, ordinateur / caméra et chambre d'écoulement à plaques parallèles sont placés dans un arrangement optimal pour l'analyse cellulaire efficace et reproductible. Tournez sur la puissance et la source de lumière pour microscope inversé et le pouvoir de la pompe seringue et sélectionnez l'objectif 10x sur le microscope. Placer 50 ml tube conique dans le support et la remplir de H / H et 2mm CaCl 2. Placer les tubes à essai en plastique de 5 ml dans le porte-tube à essai en dessous du tube de 50 ml coniques Placer 60 ml seringue dans la seringue électrique (Soyez sûr que les deux sur le piston et le corps de seringue sont à la fois sécurisé). Fixez 3-way robinet d'extrémité de la seringue de 60 ml et joindre une seringue de 5 ml à 3 voies robinet. Placer un appareil parallèle Chambre de circulation (GlycoTech, Inc) sur scène microscope avec tube d'entrée vers la droite, le tube de sortie à gauche et à tubes sous vide à l'arrière. Fixez tube à vide au vide et valve d'air ouverte pour permettre à un appareil à plaques parallèles d'adhérer à la scène. (Ce teste si la jupe de vide sur la chambre d'écoulement est étanche à l'air.) Tournez le robinet d'air. Attacher la ligne de sortie tube (à gauche du microscope) à 3 voies robinet. Appareil est maintenant prêt pour la mise sur plaque monocouche HBMEC-60. Plaque monocouche Placez HBMEC-60 et le placer sur le centre du microscope. Allumez le vide et la position de l'appareil de chambre de circulation au-dessus du plateau de telle sorte que la plaque monocouche est au centre. Abaissez doucement l'appareil chambre d'écoulement sur la plaque monocouche HBMEC-60 et un appareil permettant de chambre d'écoulement d'aspiration vers le bas. (Il ne faut pas les sons de l'air qui s'échappe et à ce stade, vous pourriez avoir besoin pour appliquer une pression à la chambre pour comprimer le joint en caoutchouc.) Une fois vide a été créé, le tube d'entrée place (à droite) dans le tube conique contenant 50 ml H / H avec 2 mM CaCl 2. Ouvrez 3-way robinet pour permettre l'écoulement dans la seringue de 60 ml et d'une pompe dans "mode pompe." Pour éliminer l'air d'entrée / sortie sans soulever les cellules sur la plaque, utiliser la pompe seringue fixé à 2mL/minute pour remplir le tube d'admission, puis rapidement réglé à 0,5 ml / minute, juste avant le fluide atteint l'appareil. Il est impératif d'amorcer cette mise en place avec soin et éviter les bulles d'air qui va soulever la monocouche de la plaque. Une fois que le fluide est vu passer dans la seringue de 60 ml, la chambre de circulation et pompe seringue ont été amorcées et la chambre de flux est prêt à l'emploi. Cette mise en place sera répétée pour chaque exécution d'entrée de cellule et pour chaque nouvelle plaque nécessaire. 4. Capturer des leucocytes roulant événements en utilisant les éléments de NIS Ouvrez Elements NIS sur le bureau. Appuyez sur "play" icône de l'image en direct. L'exposition automatique vous permettra de voir la plaque plus facile pour l'instant et il est important de se concentrer. Soyez sûr que microscope est correctement mis sur la monocouche cellulaire. Une fois concentré, re-mis en exposition à la lumière une image / seconde et d'ajuster sur le microscope. L'image doit apparaître sur l'ordinateur et ne sera plus visible dans le viseur de microscope en raison de la faible clarté. Histogramme lumière peut alors être adjusted pour enlever l'exposition de fond ou d'améliorer la clarté des cellules. Cliquez sur bin 2X2 ou Bin Live pour obtenir une image qui est idéal pour la capture de film Cliquez sur "Macro" sur la barre de menu et sélectionner "écrire sur le port", sélectionnez le port "com3", et "ouverte". (Ceci ouvre le port afin de coordonner avec le pousse-seringue. Pipeter 1 ml de suspension cellulaire KG1a dans l'éprouvette 5ml près de la ligne tube d'entrée et ensuite placer la ligne d'entrée tuyau au fond de l'éprouvette. Aller à la barre de menu, cliquez sur "Capture", "time-lapse d'acquisition." Un nouveau menu apparaîtra. Sélectionnez le protocole durables 210 secondes, c'est la longueur du programme pour rouler sur HBMEC-60 cellules. (Chaque phase est programmée pour prendre une photo à chaque seconde pour la durée du protocole de la pompe. Il est également mis en place pour envoyer une commande par le port COM3 pour démarrer la pompe.) Si time-lapse est interrompue, la pompe ne s'arrêtera pas sur ses propres et doit être réinitialisé. Appuyez sur Annuler pour retourner vivre l'image. Régler la pompe seringue de "mode Programme", selon le manuel d'instructions. (Mode Programme permet de programmation manuelle des débits spécifiques (à savoir des niveaux de stress de cisaillement) pour être transmises dans la chambre et de dicter les interactions cellulaires au cours de la monocouche KG1a HBMEC-60 cellules). Réglages pour la cellule KG1a roulant sur les cellules HBMEC ont été les suivants 4,2 dynes / cm 2 pendant 45 s, 0,3 dynes / cm 2 pendant 60 s, et une augmentation progressive toutes les 15 s à un maximum de 4,2 dynes / cm 2 Mur contraintes de cisaillement (W st) dans la chambre a été calculé selon l'équation suivante: W = st 6μQ / a, b 2, où μ est la viscosité estimé des médias (0,0076 P), Q est le débit volumique en ml / s, un canal est la hauteur (épaisseur du joint) en cm (0,03 cm), et b est la largeur du canal en cm (0,5 cm). Les débits ont été réglementées en utilisant le mode programme de la pompe à seringue. Microscope et l'ordinateur sont maintenant prêts à capturer une séquence en accéléré. Appuyez sur "Start Run" sur l'ordinateur pour commencer à acquérir des données. Lors de l'exécution du programme, n'oubliez pas d'ajouter des médias à l'éprouvette contenant des cellules KG1a afin de maintenir le tuyau d'entrée / sortie complète de support (Assurez-vous qu'il n'ya pas de bulles d'air). 5. Dépendance de sialylation Terminal et glycoprotéine de surface pour la E-sélectine-médiation cellulaire KG1a 5. Roulant (figure 2; Clips Vidéos du 05/01 au 05/05) Dosage de la cellule KG1a roulant sur ​​non-stimulés HBMEC-60 cellules. (Contrôle négatif), les cellules ont été préparées et KG1a infusé dans la chambre d'écoulement plus vivant non-IL-1β stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. Dosage de la cellule KG1a roulant sur ​​HBMEC-60 cellules pré-traitées avec de l'IL-1β. (E-sélectine-dépendance de contrôle) cellules KG1a ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l'IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. Dosage de la cellule KG1a roulant sur ​​HBMEC-60 cellules pré-traitées avec de l'IL-1β, puis en neutralisant anti-humain E-sélectine Moab. (E-sélectine-dépendance de contrôle) cellules KG1a ont été préparés et infusés dans la chambre d'écoulement plus vivent IL- 1β stimulée HBMEC-60 prétraitées avec neutralisants anti-humain E-sélectine AcMo comme décrit plus haut. Dosage de la sialidase digérée cellules KG1a roulant sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60. Cellules prétraitées avec KG1a 0.1U/ml Vibrio cholerae neuraminidase pendant 1 heure à 37 ° C ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l'IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. Dosage de la protéase cellulaire digérée KG1a roulant sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60. Cellules prétraitées avec KG1a protéase, bromélaïne 0.2U/ml pendant 1 heure à 37 ° C, ont été préparés et infusés dans la chambre de circulation au cours de l'IL-1β direct stimulée HBMEC-60 comme décrit ci-dessus. 6. Analyse de la NIS-Elements-Capturé Cellules KG1a et représentation graphique des données cellulaire KG1a roulant Après la séquence de temps est acquise, sauvegarder les données. Allez à «mesurer» l'onglet sur la barre de menu et sélectionner "définir le seuil." Déplacer les barres afin que les cellules désirées sont colorés en rouge. Sélectionnez "toutes les images" puis "Ok". L'ensemble du time-lapse séquence doit maintenant être modifié avec des globules rouges visibles roulant. Aller à la "mesure" et sélectionnez "restrictions". (Restrictions permettent à l'utilisateur d'exclure des objets seuillée qui ne représentent pas les cellules roulant. Ceci est principalement contexte créé par la monocouche HBMEC-60.) Sélectionnez «zone» et min d'entrée et les valeurs max de la zone de cellules roulant. Répétez cette étape pour "allongement" et "la circularité." Sélectionnez "mesure" et sélectionnez "créer binaire utilisant des restrictions", et définir les valeurs de restriction pour optimiser le logiciel de reconnaissance NIS-Elements de cellules roulant sur monocouche de cellules HBMEC-60. Retour à «mesurer», sélectionnez «données sur le terrain", puis sélectionnez «données reset". Fermer ce menu. Retour à la "mesure" et soisélectionnez «champ de lecture". Ouvrez "mesure"; "Les données de terrain», sélectionnez «numéro ou les objets" puis sélectionnez "tous les domaines» et exporter des données vers Microsoft Excel. Sélectionnez "Effacer les données» pour préparer l'acquisition de cellules NIS-Elements de collecte de données suivant. Résultats: Figure 3. Plaques parallèles Analyse Chambre de circulation de E-sélectine activité de liaison sur les cellules KG1a. Cellules traitées avec KG1a sialidase ou de la protéase ont été analysés pour l'efficacité de roulement sur des monocouches de cellules HBMEC-60 pré-traitées avec de l'IL-1β. Contrôle négatif rouler expériences ont également été menées par l'analyse de cellules KG1a rouler sur la non-IL-1β stimulée HBMEC -60 cellules ou sur l'IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules traitées avec neutralisants anti-humain E-sélectine Moab (5D11). Fréquences de laminage de cellules ont été réalisés en triple et analysées avec le logiciel NIS-Elements. (Signification statistique *, p <0,001) Dans ce rapport, basé sur la vidéo, nous avons fourni une représentation visuelle de la façon d'analyser des leucocytes – les interactions des cellules endothéliales dans des conditions physiologiques des conditions de stress de cisaillement. En particulier, nous avons analysé le rôle de la E-sélectine – E-sélectine ligands dans la médiation de tethering leucocytes et de roulement, un comportement adhésif nécessaire à l'engagement de l'enseignement secondaire plus stable des activités contraignantes par le biais des récepteurs tels que les intégrines et des récepteurs de l'acide hyaluronique. Utilisation de la chambre d'écoulement à plaques parallèles adaptées pour une utilisation avec un microscope inversé, Harvard seringue pompe, caméra vidéo et du matériel d'acquisition d'ordinateur / portable, nous avons mené des expériences dans laquelle E-sélectine ligand + cellules KG1a ont été utilisés comme notre modèle de leucocytes et de cellules HBMEC (HBMEC- 60) stimulées par des cytokines pro-inflammatoires, l'IL-1β, ont été utilisés comme notre E-sélectine + modèle de cellules humaines endothéliales (1-6). Comme indiqué précédemment, nous avons observé des cellules robustes KG1a roulant sur ​​l'IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules sur une gamme de niveaux de contrainte de cisaillement dans une manière E-sélectine-dépendant (Figure 3) (différence statistiquement significative par rapport aux cellules KG1a roulant sur non-IL-1β HBMEC-60 cellules stimulées). Des contrôles négatifs, qui se composait de cellules KG1a rouler sur la non-IL-1β stimulée HBMEC-60 cellules ou sur l'IL-1β stimulée HBEMC-60 cellules prétraitées avec anti-humain E-sélectine mAb, ont été réalisées en parallèle afin de démontrer la dépendance de stimulation des cytokines et E-sélectine expression pour l'activité de laminage (figure 3). Par ailleurs, l'analyse de laminage de cellules prétraitées avec KG1a Vibrio cholerae neuraminidase (sialidase) ou avec la bromélaïne, une protéase non spécifique connu pour digérer la E-sélectine surface de la glycoprotéine ligand, a souligné l'importance des résidus terminaux d'acide sialique et de la glycoprotéine de surface pour la E-sélectine ligand l'activité (2,3).