Summary

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

Published: October 19, 2017
doi:

Summary

Макрофагов внеклеточного ловушки являются недавно описан сущности. Эта статья будет сосредоточена на confocal микроскопии методов и как они отображаются в пробирке и в естественных условиях от образцов легких.

Abstract

Основной метод, используемый для определения присутствия нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) является confocal микроскопии. Мы изменили методы установленных confocal микроскопии визуализировать макрофагов внеклеточного ловушки (Мец). Эти внеклеточные ловушек определяются наличием внеклеточного хроматина с одним выражением других компонентов, таких как зерно протеаз, citrullinated гистонами и peptidyl arginase deiminase (PAD). Выражение Мец обычно измеряется после воздействия на раздражитель и по сравнению с ООН стимулировали образцов. Образцы также включены для фона и изотипа управления. Клетки анализируются с помощью программного обеспечения для анализа четкие изображения. Конфокальная микроскопия может использоваться для определения присутствия Мец как in vitro , так и в естественных условиях в легочной ткани.

Introduction

Нейтрофильные внеклеточного ловушки (сетки), были впервые описаны, Бринкманн et al. 1 они преимущественно производятся в ответ на инфекцию (особенно для бактерий) и имеют важную роль в принимающей обороны1,2. Они также были описаны в ответ на неинфекционных заболеваний, в том числе васкулит и системная красная волчанка (СКВ); и с Митоген phorbol 12-myrisate 13-ацетат (PMA)2,3. Недавно было признано, что другие типы клеток может также производить внеклеточные ловушки, включая макрофагов. Внеклеточные ловушки макрофагов (Мец) еще не четко определенной сущности в литературе4,5. Недавно мы создали методы для обнаружения присутствия Мец как in vitro и in vivo6,7. В этой статье будут описаны измерения с помощью конфокальной микроскопии Мец.

Основные черты NETosis, которые отличают его от других сотовых пути (например, апоптоз8) экструзии хроматина в сочетании с: (1) citrullination гистонами (H3Cit)9, (2) совместно выражение гранул протеаз10 и (3) участии peptidyl аргинин deiminase (PAD) 411,12. Макрофаги также выразить H3Cit, гранул протеаз и PAD, и эти функции могут использоваться для определения присутствия Мец.

Мец может иметь особенно важную роль в легких, как макрофагов является доминирующей в альвеолы и авиалинии легкя и первоначальный роль в управлении клеточный иммунный ответ на инфекции/воспаление. Кроме того в то время как большая часть легких является пустое пространство (например, в альвеолы), Мец потенциально способны расширить пространство, в отличие от солидных органов.

Наиболее широко используемый метод для определения наличия сетей является confocal микроскопии. Четко определенный способ измерить Мец еще не существует. Техника для измерения сеток была адаптирована для измерения присутствия Мец в настоящем Протоколе. Основные требования для данного метода являются доступ к confocal микроскопии и соответствующих изображений программное обеспечение для анализа.

Protocol

этот протокол следует эксперименты, утвержденных в: (1) люди Комитет этики Монаш медицинский центр, и (2) животных Комитетом по этике университета Мельбурна. 1. макрофаги Бронхоальвеолярный лаваж (BAL) использования бал для получения легких макрофагов в: (1) человека пре…

Representative Results

Мец могут быть визуализированы бал образцов, в легочной ткани и в толще секций легких с 3-D изображения. Пример Мец, визуализируется в BAL образец показан на рисунке 1. Морфология Мец будет зависеть от стадии их созревания. Первая особенность обнаружению п?…

Discussion

Метод, описанный в данном обзоре основан на который используется для определения присутствия сети14. Макрофаги являются на сегодняшний день доминирующей ячейки типа в образцах бал, и этот метод коллекции особенно подходит для изучения Мец. Если красные кровяные клетки при?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась грантов от университета Монаш, национального здравоохранения и медицинский исследовательский совет, Monash легких и сна института. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии в Монаш здравоохранения, Джуди Callaghan, Алекс Фульхерий, Кирстин Elgass и Камден Ло в Монаш микро Imaging (MMI) за помощь с confocal микроскопии изображений, и авторы признают услуги MMI университета Монаш. Авторы признают, зал и научной и технической помощи Монаш гистология платформы.

Materials

Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
  7. O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Play Video

Cite This Article
Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

View Video