Summary

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

Published: October 19, 2017
doi:

Summary

マクロファージ細胞外トラップは、新しく記述されたエンティティです。この資料に共焦点の顕微鏡検査方法に集中して体外体内の肺検体から可視化方法します。

Abstract

好中球細胞外トラップ (網) の存在を定義するために使用する主な方法は、共焦点顕微鏡です。確立された共焦点顕微鏡によるマクロファージ細胞外トラップ (メッツ) を可視化する方法を変更しました。これらの細胞外のトラップは、顆粒プロテアーゼ、シトルリン化ヒストン ペプチジル アルギナーゼ アルギニンデイミナーゼ (PAD) などの他のコンポーネントの共発現細胞クロマチンの存在によって定義されます。メッツの式は一般的に刺激への暴露後に測定し、非刺激のサンプルと比較しています。サンプルは背景とアイソタイプ コントロールの含まれています。細胞を分析するには、明確に定義された画像解析ソフトを用いてします。メッツの存在を定義する共焦点顕微鏡を使用することがあります体外体内の肺組織の両方。

Introduction

好中球細胞外トラップ (ネット)、最初ブリンクマンによって記述されていた1彼らは (特に細菌) への感染への応答で主に作り出され、ホストの防衛1,2で重要な役割を持っています。彼らは、非感染性疾患、血管炎、全身性エリテマトーデス (SLE); などへの応答で発生することも記載されています。・ マイトジェン ホルボール 12 myrisate 13-アセタート (PMA)2,3。最近、他の細胞型が大食細胞を含む細胞外のトラップを生成しても認識されています。マクロファージ細胞外トラップ (メッツ) はまだ文学4,5で明確に定義されたエンティティではありません。メッツの存在を検出するためのメソッドも確立の in vitroin vivo6,7。この記事でメッツの共焦点顕微鏡を用いた測定が表示されます。

(アポトーシス8) など他の細胞細道からそれを区別する NETosis の主な機能はクロマチンと組み合わせての押出: ヒストン (H3Cit)9のシトルリン (1)、(2) 顆粒プロテアーゼ10 の共発現、ペプチジル アルギニン アルギニンデイミナーゼ (PAD) 4 の (3) の関与11,12。マクロファージはまた H3Cit、顆粒プロテアーゼおよびパッドを表現し、メッツの存在を定義するこれらの機能を使用することができます。

メッツは、肺胞と肺の気道内に存在の支配的な細胞のマクロファージで、感染症/炎症細胞性免疫応答を監督の初期のロールとして、肺の特に重要な役割があります。また、肺の大部分は空スペース (例えば肺胞内) が、メッツは空き領域、固形臓器とは対照的に拡大する可能性があること。

共焦点顕微鏡は網の存在を定義する最も広く使われている方法です。まだでは、メッツを測定する明確に定義された方法はないです。ネットの測定法は、このプロトコルではメッツの存在を測定に適応されています。このメソッドの主な要件は、共焦点の顕微鏡検査および適切なイメージング ソフトウェアにアクセスし分析。

Protocol

このプロトコルに続く承認実験: (1) 倫理委員会のモナッシュ医療センター、および (2) メルボルン大学の倫理委員会の動物による人間。 1 気管支肺胞洗浄 (BAL) マクロファージ 肺マクロファージを取得する使用バル: (1) 人間は気管内吸引を用いた気管支鏡検査 6、および (2) マウスで科目 13。. 注意: マクロファージの獲得…

Representative Results

メッツは、バル サンプル、肺組織、3次元画像でより厚い肺セクションからビジュアル化する可能性があります。メッツ バル サンプルの可視化の例は、図 1に示すです。メッツの形態は、成熟の段階によって異なります。顕微鏡の最初の検出機能は、セルの端に核の運動です。その後に、H3Cit と顆粒のプロテアーゼなどの他の共発現メディエー?…

Discussion

このレビューで説明している手法はネット14の存在を定義するために使用しました。マクロファージは、バルのサンプルで支配的なセルの種類とコレクションのこのメソッドは、メッツを勉強するために最適です。赤血球が、バルの存在する場合、これらの細胞は塩化アンモニウムを使用して分離する必要があります。バル プロシージャが一般にマクロファージをアクティ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、モナッシュ大学、国民の健康および医学研究評議会とモナッシュ肺と睡眠研究所からの助成金によって賄われていた。著者は共焦点の顕微鏡検査の映像とヘルプのモナッシュ健康、ジュディ ・ キャラハン、アレックス Fulcher、Kirstin Elgass、カムデン Lo のモナッシュ マイクロ イメージング (MMI) で臨床免疫学のスタッフを感謝したいし、著者認める MMI 設備モナッシュ大学。著者は、施設、モナッシュ組織プラットフォームの科学的な技術的な支援を認めます。

Materials

Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

References

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Cite This Article
Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

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