Summary

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

Published: October 19, 2017
doi:

Summary

Macrophage pièges extracellulaires sont une entité nouvellement décrite. Cet article se concentre sur les méthodes de microscopie confocale et comment elles sont visualisées in vitro et in vivo des échantillons pulmonaires.

Abstract

Une méthode primaire utilisée pour définir la présence de pièges extracellulaires neutrophiles (filets) est la microscopie confocale. Nous avons modifié les méthodes de microscopie confocale établies afin de visualiser les pièges extracellulaires de macrophages (METs). Ces pièges extracellulaires sont définis par la présence de la chromatine extracellulaire avec co-expression d’autres composants tels que les protéases de granule et les histones citrullinés peptidyl arginase déiminase (PAD). L’expression des METs est généralement mesurée après exposition à un stimulus et par rapport aux échantillons non stimulés. Des échantillons sont également inclus pour le contrôle de fond et isotype. Les cellules sont analysées à l’aide de logiciels d’analyse des images bien définies. Microscopie confocale peut être utilisée pour définir la présence de METs in vitro et in vivo dans les tissus pulmonaires.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), ont été d’abord décrit par Brinkmann et al. 1 ils sont principalement produits en réponse à l’infection (en particulier aux bactéries) et ont un rôle important dans l’hôte défense1,2. Ils ont également été décrits pour se produire en réponse aux maladies non infectieuses, y compris vascularite et lupus érythémateux disséminé (LED) ; et aux mitogènes phorbol 12-myrisate 13-acétate (PMA)2,3. Il a été reconnu récemment que les autres types de cellules peuvent également produire pièges extracellulaires, tels que les macrophages. Pièges extracellulaires de macrophages (METs) ne sont pas encore une entité bien définie dans la littérature4,5. Nous avons récemment établi des méthodes pour détecter la présence de METs aussi bien in vitro et in vivo,6,7. Dans cet article, on décrira la mesure des METs à l’aide de la microscopie confocale.

Caractéristiques principales de NETosis qui la distinguent des autres voies cellulaires (par exemple l’apoptose8) sont l’extrusion de la chromatine en collaboration avec : (1) la citrullination d’histones (H3Cit)9, (2) la co-expression de protéases granule10 et (3) participation des peptidyl arginine déiminase (PAD) 411,12. Macrophages expriment aussi H3Cit, protéases de granule et PAD, et ces caractéristiques peuvent être utilisés pour définir la présence des METs.

METs peuvent avoir un rôle particulièrement important dans le poumon, comme les macrophages sont la cellule dominante présente dans les alvéoles et les voies respiratoires du poumon et a le rôle initial dans la direction de la réponse immunitaire cellulaire à l’infection/inflammation. En outre, même si une grande partie du poumon est vide (par exemple, dans les alvéoles), les METs sont potentiellement en mesure d’étendre dans l’espace disponible, contrairement aux organes solides.

La méthode la plus utilisée pour définir la présence de filets est par microscopie confocale. Il n’a pas encore un moyen clairement défini pour mesurer les METs. La technique de mesure des filets a été adaptée pour mesurer la présence des METs dans le présent protocole. Les principales exigences pour cette méthode sont les accès à la microscopie confocale et logiciels d’imagerie appropriées pour l’analyse.

Protocol

ce protocole suit approuvés dans des expériences : les humains (1) par l’éthique Comité de Monash Centre médical et les animaux (2) par le Comité d’éthique de l’Université de Melbourne. 1. Lavage broncho-alvéolaire (LBA) Macrophages BAL d’usage pour obtenir les macrophages pulmonaires en : (1) homme soumet par bronchoscopie 6 et la souris (2) à l’aide d’aspiration trachéale intra 13 . NOTE : Acquisit…

Representative Results

METs peuvent visualiser à partir d’échantillons de BAL, dans les tissus pulmonaires et dans les sections de poumon plus épaisses avec des images 3D. Un exemple de METs visualisées dans un échantillon de BAL est illustré à la Figure 1. La morphologie des METs variera selon leur stade de maturation. La première caractéristique décelable au microscope est le mouvement du noyau jusqu’au bord de la cellule. Elle est suivie d’une chromatine extracel…

Discussion

La méthode décrite dans la présente analyse est fondée sur celle utilisée pour définir la présence de filets14. Les macrophages sont de loin le type de cellule dominante dans les échantillons de BAL et cette méthode de collecte est particulièrement adaptée pour l’étude des METs. Si les globules rouges sont présents dans le BAL, ces cellules doivent être lysées par à l’aide de chlorure d’ammonium. La procédure de BAL généralement pour activer les macrophages et par conséqu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par des subventions de la Monash University, National Health et Medical Research Council et le poumon de Monash et Institut sommeil. Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’immunologie clinique santé de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass et Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) de l’aide avec l’imagerie de la microscopie confocale, et les auteurs reconnaissent les installations MMI de l’Université Monash. Les auteurs remercient les installations et une assistance scientifique et technique de la plate-forme de l’histologie de Monash.

Materials

Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
  7. O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Play Video

Cite This Article
Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

View Video