Summary

Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

Published: October 19, 2017
doi:

Summary

Macrófago extracelulares armadilhas são uma entidade recentemente descrita. Este artigo se concentrará em métodos de microscopia confocal e como eles são visualizadas in vitro e em vivo de amostras do pulmão.

Abstract

Um método primário usado para definir a presença de neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) é a microscopia confocal. Modificamos a microscopia confocal estabelecidos métodos para visualizar armadilhas extracellular do macrófago (METs). Estas armadilhas extracelulares são definidas pela presença de cromatina extracelular com expressão co de outros componentes como proteases do grânulo, citrulinado histonas e peptidyl arginase deiminase (PAD). A expressão dos METs geralmente é medida após a exposição a um estímulo e em comparação com amostras não-estimuladas. As amostras também estão incluídas para plano de fundo e do isotipo controle. As células são analisadas usando software de análise de imagem bem definida. Microscopia confocal pode ser usada para definir a presença de metástases tanto in vitro e em vivo no tecido pulmonar.

Introduction

Neutrófilos armadilhas extracelulares (redes), foi primeiramente descrito pelo Brinkmann et al 1 eles são predominantemente produzidos em resposta à infecção (especialmente para as bactérias) e têm um papel importante na defesa de anfitrião1,2. Eles também têm sido descritos para ocorrer em resposta a doenças não-infecciosas, incluindo vasculite e Lúpus eritematoso sistémico (SLE); e ao mitógeno phorbol 12-myrisate 13-acetato (PMA)2,3. Recentemente foi reconhecido que outros tipos de células podem também produzir armadilhas extracelulares, incluindo macrófagos. Armadilhas extracellular do macrófago (METs) ainda não são uma entidade bem definida na literatura4,5. Nós recentemente estabeleceram métodos para detectar a presença de metástases tanto in vitro e in vivode6,7. Neste artigo, será descrita a medição dos METs usando microscopia confocal.

Principais características do NETosis que a distinguem de outras vias celulares (como a apoptose8) são a extrusão da cromatina em conjunto com: (1) citrullination de histonas (H3Cit)9, (2) expressão co de proteases grânulo10 e (3) participação do peptidyl arginina deiminase (PAD) 411,12. Os macrófagos também expressam H3Cit, proteases do grânulo e almofada, e esses recursos podem ser usados para definir a presença de metástases.

Os METs podem ter um papel particularmente importante no pulmão, como o macrófago é a célula dominante presente nos alvéolos e vias aéreas do pulmão e tem papel inicial na direção da resposta imune celular a infecção/inflamação. Além disso, enquanto grande parte do pulmão é espaço vazio (por exemplo, dentro do alvéolo), os METs são potencialmente capazes de expandir-se para o espaço disponível, em contraste com órgãos sólidos.

O método mais utilizado para definir a presença de redes é por microscopia confocal. Não há ainda uma maneira claramente definida para medir METs. A técnica para a medição de redes tem sido adaptada para medir a presença de metástases no presente protocolo. Os requisitos principais para este método são acesso a microscopia confocal e software de imagem apropriado para análise.

Protocol

este protocolo segue experiências aprovadas em: (1) os seres humanos pelo Comitê de ética de Monash Medical centro e (2) animais pelo Comitê de ética da Universidade de Melbourne. 1. macrófagos do lavado broncoalveolar (BAL) BAL de uso para obter os macrófagos pulmonares em: (1) humanos sujeitos por broncoscopia 6 e (2) ratos usando aspiração intratraqueal 13 . Nota: Aquisição de macrófagos em geral, causa uma ati…

Representative Results

Os METs podem ser visualizados de amostras de BAL, no tecido pulmonar e nas seções mais grossas de pulmão com imagens em 3D. Um exemplo de METs visualizado em uma amostra de BAL é mostrado na Figura 1. A morfologia do METs irá variar de acordo com seu estágio de maturação. A primeira característica detectável na microscopia é o movimento do núcleo à borda da célula. Isto é seguido por cromatina extracelular com outros mediadores co expressas, t…

Discussion

O método descrito nesta revisão é baseado em que usado para definir a presença de redes14. Os macrófagos são, de longe, o tipo de célula dominante em amostras de BAL… e este método de coleta é particularmente adequado para o estudo dos METs. Se células vermelhas do sangue estiverem presentes no BAL, estas células devem ser lysed usando cloreto de amônio. O procedimento de BAL geralmente irá ativar os macrófagos e, portanto, espera-se que haverá METs presentes em amostras não-esti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por doações da Monash University, National Health e Medical Research Council e o pulmão de Monash e Instituto do sono. Os autores gostaria de agradecer o pessoal da imunologia clínica na saúde de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass e Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) para obter ajuda com a microscopia confocal da imagem latente, e os autores reconhecem as instalações do MMI da Universidade de Monash. Os autores reconhecem a instalações e assistência científica e técnica da plataforma de histologia de Monash.

Materials

Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
  7. O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Play Video

Cite This Article
Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

View Video