Summary

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

Published: October 19, 2017
doi:

Summary

Makrophagen extrazelluläre fallen sind eine neu beschriebene Einheit. Dieser Artikel konzentriert sich auf Methoden der konfokalen Mikroskopie und wie sie sind visualisiert in Vitro und in Vivo aus Lunge Proben.

Abstract

Eine bevorzugte Methode verwendet, um das Vorhandensein von Neutrophilen extrazelluläre Traps (NETs) zu definieren ist konfokalen Mikroskopie. Wir haben etablierte konfokalen Mikroskopie Methoden zur Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) modifiziert. Diese extrazellulären fallen werden durch das Vorhandensein von extrazellulären Chromatin mit Co Ausdruck anderer Komponenten wie Granulat Proteasen, citrullinierte Histone und Peptidyl Arginase Deiminase (PAD) definiert. Der Ausdruck der METs in der Regel nach der Exposition auf einen Reiz gemessen und im Vergleich zu un-stimulierten Proben. Proben sind auch für Hintergrund und Isotype Kontrolle enthalten. Zellen werden mit genau definierten Bildanalyse-Software analysiert. Konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um das Vorhandensein von METs definieren sowohl in Vitro und in Vivo im Lungengewebe.

Introduction

Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs), wurden zuerst von Brinkmann Et Al. beschrieben 1 sie sind überwiegend als Reaktion auf die Infektion (vor allem Bakterien) hergestellt und haben eine wichtige Rolle im Host Verteidigung1,2. Sie sind auch beschrieben worden, um als Reaktion auf nicht-infektiösen Krankheiten, einschließlich Vaskulitis und systemischer Lupus erythematodes (SLE); und die Mitogen Phorbol 12-Myrisate 13-Acetat (PMA)2,3. Es ist vor kurzem erkannt worden, dass andere Zelltypen auch extrazelluläre fallen, einschließlich der Makrophagen produzieren können. Makrophagen extrazelluläre fallen (METs) sind noch nicht definierte Entität in der Literatur4,5. Vor kurzem haben wir Methoden, um das Vorhandensein von METs in Vitro und in Vivo6,7. In diesem Artikel wird die Messung der METs mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beschrieben.

Hauptmerkmale der NETosis die Unterscheidung von anderen zellulären Wege (z. B. Apoptose8) sind die Extrusion von Chromatin in Verbindung mit: (1) Citrullination der Histone (H3Cit)9, (2) Co Ausdruck von Granulat Proteasen10 , und (3) Einbeziehung der Peptidyl Arginin Deiminase (PAD) 411,12. Makrophagen auch ausdrücken, H3Cit, Granulat Proteasen und PAD, und diese Funktionen können verwendet werden, um das Vorhandensein von METs zu definieren.

METs haben eine besonders wichtige Rolle in der Lunge, da die Makrophagen die dominante Zelle in die Alveolen und die Atemwege der Lunge vorhanden und die erste Rolle hat in der Leitung der zellulären Immunantwort auf Infektionen/Entzündungen. Darüber hinaus zwar ein Großteil der Lunge leeren Raum (z. B.innerhalb der Alveolen), sind die METs potenziell in der Lage, in den Raum zur Verfügung, im Gegensatz zu soliden Organe zu erweitern.

Die am weitesten verbreitete Methode, um das Vorhandensein von Netzen zu definieren ist von konfokalen Mikroskopie. Es gibt nicht noch eine klar definierte Methode zum Messen der METs. Die Technik für die Messung der Netze wurde angepasst um das Vorhandensein von METs in diesem Protokoll zu messen. Die wichtigsten Anforderungen für diese Methode sind Zugriff auf konfokalen Mikroskopie und entsprechende imaging-Software für die Analyse.

Protocol

dieses Protokoll folgt Experimente in zugelassen: (1) Menschen von der Ethik Komitee der Monash Medical Center und (2) Tiere, die von der Ethikkommission der Universität Melbourne. 1. alvéolaire Lavage (BAL) Makrophagen Verwendung BAL Lung Makrophagen in zu erhalten: (1) menschliche Themen durch Bronchoskopie 6 und (2) Mäuse mit Intra-trachealen streben 13 . Hinweis: Erwerb von den Makrophagen führt in der Regel einige Ak…

Representative Results

METs können von BAL-Proben, im Lungengewebe und in dickeren Bereiche der Lunge mit 3-d-Bildern sichtbar gemacht werden. Ein Beispiel der METs visualisiert in einer BAL-Probe ist in Abbildung 1dargestellt. Die Morphologie der METs variiert je nach ihrem Stadium der Reifung. Die ersten nachweisbare Funktion auf Mikroskopie ist die Bewegung des Kerns an den Rand der Zelle. Dies folgt extrazelluläre Chromatin mit anderen Co ausgedrückten Mediatoren, wie H3Cit …

Discussion

In diesem Beitrag beschriebene Methode basiert auf, die für die Definition der Präsenz der Netze14verwendet. Makrophagen sind bei weitem die dominierende Zelltyp in BAL-Proben und diese Methode der Sammlung eignet sich besonders für das Studium der METs. Wenn die roten Blutkörperchen in der BAL vorhanden sind, sollten diese Zellen lysiert werden, mithilfe von Ammoniumchlorid. Das BAL-Verfahren wird in der Regel die Makrophagen aktivieren und daher voraussichtlich werden METs in un-stimulierten…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der Monash University, National Health und Medical Research Council und der Monash Lungen- und Schlaf Institut finanziert. Die Autoren möchten die Mitarbeiter der klinischen Immunologie an der Monash Gesundheit, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass und Camden Lo der Monash Micro Imaging (MMI) für Hilfe mit der konfokalen Mikroskopie imaging danken, und die Autoren erkennen die MMI-Einrichtungen der Monash University. Die Autoren erkennen die Einrichtungen und die wissenschaftliche und technische Unterstützung der Monash Histologie Plattform.

Materials

Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
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  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
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  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
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Cite This Article
Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

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