Summary

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

Published: October 19, 2017
doi:

Summary

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

Abstract

שיטה העיקרי המשמש להגדרת הנוכחות של מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו ששינית מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות). אלה מלכודות חוץ-תאית מוגדרים על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של רכיבים אחרים כמו גרגר פרוטאזות, שינויים היסטוניים citrullinated peptidyl arginase deiminase (מקלדת). הביטוי של המטס בדרך כלל נמדד לאחר חשיפה לגירוי, לעומת דגימות לא מגורה. דוגמאות כלולים גם על רקע ושליטה isotype. התאים הם ניתחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה מוגדרים היטב. מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לשמש כדי להגדיר את הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו ברקמת הריאה.

Introduction

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), שתוארו לראשונה על-ידי. Brinkmann et al. 1 הם מיוצרים בעיקר בתגובה לזיהום (במיוחד לחיידקים) ויש להם תפקיד חשוב ב מארח ההגנה1,2. הם גם תוארו להתרחש בתגובה מחלות שאינן זיהומיות, כולל דלקת בכלי הדם, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן); ו mitogen phorbol 12-myrisate 13-אצטט (PMA)2,3. זה לאחרונה הוכר כי סוגי תאים אחרים אולי גם לייצר מלכודות חוץ-תאית, כולל מקרופאגים. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות) עדיין אינם ישות מוגדרים היטב הספרות4,5. לאחרונה הקמנו שיטות כדי לזהות הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו6,7. במאמר זה, המדידה של המטס שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית יתוארו.

תכונות עיקריות של NETosis אשר להבחינו מסלולים סלולר אחרים (כגון אפופטוזיס8) הם ההבלטה של כרומטין בשיתוף עם: (1) citrullination של שינויים היסטוניים (H3Cit)9, (2) ביטוי משותף של פרוטאזות גרגר10 , (3) מעורבות של peptidyl deiminase ארגינין (PAD) 411,12. מקרופאגים אקספרס גם H3Cit, גרגר פרוטאזות, PAD, ניתן להשתמש בתכונות אלה כדי להגדיר את הנוכחות של המטס.

המטס ייתכן תפקיד חשוב במיוחד בריאה, כפי מקרופאג התא דומיננטי נוכח alveoli ואת דרכי הנשימה של הריאות, יש את התפקיד הראשוני של בימוי התגובה החיסונית הסלולר זיהום/דלקת. בנוסף, בעוד הרבה של הריאות הוא חלל ריק (למשל, בתוך alveoli), הגרורות מסוגלים פוטנציאלי להרחיב השטח הזמין, בניגוד לאיברים מוצקים.

השיטה הנפוצה ביותר מגדירים את הנוכחות של רשתות היא על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש עדיין אינה דרך ברורה כדי למדוד את המטס. הטכניקה לשקילת רשתות כבר מותאם כדי למדוד את הנוכחות של המטס ב פרוטוקול זה. הדרישות העיקריות של שיטה זו הם גישה מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת הדמיה המתאים לניתוח.

Protocol

פרוטוקול זה בעקבות ניסויים אושרה: (1) בני אדם לפי האתיקה הוועדה של מונש מרכז רפואי וכן בעלי חיים (2) על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן. 1. מקרופאגים Bronchoalveolar שטיפה (BAL) BAL שימוש כדי להשיג מקרופאגים ריאות ב: (1) האדם נושאים על ידי ברונכוסקופיה 6 ו- (2) עכברים ב?…

Representative Results

מטס, ניתן לאבחן מדגימות BAL, רקמת הריאה, בסעיפים ריאות עבה יותר עם תמונות תלת-ממדיות. דוגמה של המטס דמיינו במדגם BAL מוצג באיור1. המורפולוגיה של הגרורות ישתנה בהתאם שלהם שלב של התבגרות. התכונה הראשונה לזיהוי על מיקרוסקופ הוא התנועה של הגרעין לקצה של התא. זה מלו…

Discussion

השיטה המתוארת בסקירה זו מבוססת בשימוש עבור הגדרת הנוכחות של רשתות14. מקרופאגים עד כה סוג התא דומיננטי בדגימות BAL, שיטה זו של אוסף זה מתאים במיוחד ללמוד הגרורות. אם תאי דם אדומים נוכח הכדור, תאים אלה צריך להיות lysed על-ידי שימוש אמוניום כלוריד. ההליך BAL יהיה בדרך כלל להפעיל את המקרו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי מענקים אוניברסיטת מונש, הבריאות הלאומיים, המועצה למחקר רפואי, ריאות מונש ואת מכון שינה. המחברים רוצה להודות לצוות אימונולוגיה קלינית בבית הבריאות מונש, ג’ודי קלהאן, אלכס פולקו, השולחן שלי Elgass ו קמדן Lo של מונש מיקרו הדמיה (MMI) לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה, ולהכיר המחברים את המתקנים MMI אוניברסיטת מונש. המחברים להכיר את מתקני וסיוע המדעית והטכנית של פלטפורמת היסטולוגיה מונש.

Materials

Human samples: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12 Novus Biological NB110-57214 1:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9 Novus Biological AB119906 1:200 ascites, no concentration given
Rabbit anti-human PADI2/PAD2 Abcam AB16478 7 ug/ml
Mouse anti-human PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Sheep anti-human NE LifeSpan Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Name Company Catalog Number Comments
Mouse samples: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9 Abcam AF909 10 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26) Abcam AB5103 10 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80 In-house (hybridoma) In house 20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NE Sapphire Bioscience LS-B4244 25 ug/ml
Mouse anti-human ­­­­PADI4/PAD4 Abcam AB128086 10.1 ug/ml
Super-frost plus slides Menzel S41104A
Dapi-prolong gold Molecular probes P36931
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 85111
Ammonium chloride Sigma-Aldrich E9434
Name Company Catalog Number Comments
Secondary antibodies
Chicken anti-rabbit AF 488/ Life technologies A-21441
Chicken anti-rabbit AF 594 Life technologies A-21442
Chicken anti-goat AF 594 Life technologies a-21468
Chicken anti-mouse AF488 Life technologies A-21200
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11018
Chicken anti-mouse AF 647 Life technologies A-21463
Donkey anti-sheep AF 594 Life technologies A-11016
Isotype control
Rabbit IgG In house
Rabbit IgG In house
Mouse IgG1 BD Bioscience 550878
Rabbit IgG In house
Mouse IgG2a BioLegend 400201
Sheep IgG In house
Name Company Catalog Number Comments
Software Programs
Imaris Bitplane
Image J NIH
To average intensity of fluorphores a standard office application like Microsoft Excel can be used
Name Company Catalog Number Comments
Microscopes
C1 Confocal scanning microscope Nikon
FV1200 Confocal scanning microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Tissue sources
Human BAL samples from the bronchoscopy suite at Monash Medical Centre
Mouse BAL samples and lung tissue from the Department of Pharmacology, University of Melbourne.
Name Company Catalog Number Comments
Media
RPMI Sigma-Aldrich r8758
Fetal calf serum Sigma-Aldrich F0926
L-glutamine Sigma-Aldrich G7513
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
Sudan black Sigma-Aldrich 199664
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative Sigma-Aldrich 27387
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Natural formalin Sigma-Aldrich 42904
Paraffin Sigma-Aldrich 327204
Agarose Sigma-Aldrich A2576
Solvent 3B Hi-Chem 2026
Coverslips 12 ml Sigma-Aldrich S1815
Coverslips 60 x 24 ml Sigma-Aldrich C6875
Name Company Catalog Number Comments
Mice
c57 black 6 Monash animal research platform (MARP)
BALB/c MARP

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1 (2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  6. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PloS one. 10 (3), e0120371 (2015).
  7. O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  10. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).
  11. Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. Activation of PAD4 in NET formation. Front Immunol. 3, 360 (2012).
  12. Lewis, H. D., et al. Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation. Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).
  13. Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).
  14. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).
  15. Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).
  16. Wong, K. W., Jacobs, W. R. Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis. J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).

Play Video

Cite This Article
Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56459, doi:10.3791/56459 (2017).

View Video