Una línea versátil para analizar los cambios dinámicos en los cuerpos nucleares en una variedad de tipos de células

La organización del genoma eucariota está gobernada por múltiples capas de modificaciones epigenéticas¹, que coordinan varias funciones nucleares que pueden ocurrir dentro de compartimentos especializados llamados cuerpos nucleares o condensados². Dentro de estas estructuras, tienen lugar procesos como la iniciación de la transcripción³, el procesamiento del ARN ^4,5,6, la reparación del ADN ^7,8, la biogénesis del ribosoma ^9,10,11 y la regulación de la heterocromatina^12,13. La regulación de los cuerpos nucleares se ajusta en las dimensiones espaciales y temporales para adaptarse a los requisitos celulares, guiada por los principios de separación de fases^14,15. En consecuencia, estos cuerpos funcionan como fábricas transitorias donde los componentes funcionales se ensamblan y desensamblan, sufriendo cambios en el tamaño y la distribución espacial. Por lo tanto, la comprensión de las características de las proteínas nucleares mediante microscopía, incluida su propensión a formar cuerpos y su disposición espacial en diferentes condiciones celulares, ofrece información valiosa sobre sus roles funcionales. La microscopía de fluorescencia es un método ampliamente utilizado para el estudio de proteínas nucleares, permitiendo su detección a través de anticuerpos fluorescentes o expresando directamente dianas con un reportero de proteínas fluorescentes^16,17.

En este contexto, los cuerpos nucleares aparecen como focos brillantes o puncta, con un notable grado de esfericidad, lo que los hace fácilmente distinguibles del ambiente circundante ^16,18. Las técnicas de superresolución como STORM y PALM, al proporcionar una resolución mejorada (hasta 10 nm)¹⁹, permiten una caracterización más precisa de la estructura y composición de condensados específicos²⁰. Sin embargo, su accesibilidad está limitada por los gastos de equipo y las habilidades especializadas necesarias para el análisis de datos. Por lo tanto, la microscopía confocal sigue siendo popular debido a su equilibrio favorable entre resolución y uso más amplio. Esta popularidad se ve facilitada por la eliminación inherente de la luz desenfocada, que disminuye la necesidad de extensos procedimientos de posprocesamiento para una segmentación precisa, su amplia disponibilidad en los institutos de investigación, su tiempo de adquisición efectivo y la preparación de muestras que suele ser eficiente. Sin embargo, la medición precisa de la distribución, el ensamblaje o la difusión de proteínas mediante ensayos de inmunofluorescencia en diversas condiciones celulares plantea desafíos, ya que muchos métodos existentes carecen de orientación sobre la selección de parámetros adecuados para proteínas con diferentes patrones de distribución²¹. Además, el manejo del gran volumen de datos resultante puede ser desalentador para los usuarios con experiencia limitada en el análisis de datos, lo que puede comprometer la importancia biológica de los resultados.

Para abordar estos desafíos, presentamos un protocolo detallado paso a paso para la preparación de inmunofluorescencia y el análisis de datos, con el objetivo de proporcionar un método imparcial para cuantificar la tinción de proteínas con varios patrones de organización (Figura 1). Esta tubería semiautomatizada está diseñada para usuarios con experiencia limitada en análisis computacional y de imágenes. Combina las funcionalidades de dos plugins establecidos de Fiji: FindFoci²² y 3D suite²³. Al integrar la capacidad de identificación precisa de focos de FindFoci con las funciones de identificación y segmentación de objetos en el espacio 3D que ofrece 3D suite, nuestro enfoque genera dos archivos CSV por canal para cada campo de adquisición. Estos archivos contienen información complementaria que facilita el cálculo de métricas adecuadas para varios tipos de distribución de señales, como el recuento de focos por célula, la distancia de los focos al centroide nuclear y el coeficiente de inhomogeneidad (CI), que hemos introducido para la tinción difusa de proteínas. Además, reconocemos que la extrapolación de datos puede llevar mucho tiempo para los usuarios con habilidades limitadas de manejo de datos. Para agilizar este proceso, proporcionamos un script de Python que compila automáticamente todas las mediciones recopiladas en un solo archivo para cada experimento. Los usuarios pueden ejecutar este script sin necesidad de instalar ningún software de lenguaje de programación. Proporcionamos un código ejecutable en Google Colab, una plataforma basada en la nube que permite la escritura de scripts de Python directamente en el navegador. Esto garantiza que nuestro método sea intuitivo y fácilmente accesible para su uso inmediato.

Demostramos la efectividad de nuestro protocolo en el análisis y cuantificación de alteraciones en la distribución de señales de dos proteínas nucleares: la proteína 4 que contiene bromodominio (BRD4) y el supresor de zeste-12 (SUZ12). BRD4 es una proteína coactivadora bien documentada dentro del complejo mediador conocida por formar condensados asociados con la iniciación transcripcional dependiente de la polimerasa II^24,25. SUZ12 es un componente proteico del Complejo Represivo Polycomb 2 (PRC2) responsable de regular la deposición de la modificación de histonas H3K27me3^26,27. Estas proteínas exhiben diferentes patrones dentro de dos tipos de células distintas: las células T humanas CD4⁺ naïve recién aisladas, que están inactivas y exhiben tasas lentas de actividad transcripcional, y las células T_H1 CD4⁺ diferenciadas in vitro, que son células efectoras proliferantes especializadas que muestran una mayor transcripción²⁸.