Um pipeline versátil para analisar mudanças dinâmicas em corpos nucleares em uma variedade de tipos de células

A organização do genoma eucariótico é governada por múltiplas camadas de modificações epigenéticas¹, coordenando várias funções nucleares que podem ocorrer dentro de compartimentos especializados chamados corpos nucleares ou condensados². Dentro dessas estruturas, ocorrem processos como iniciação da transcrição³, processamento de RNA ^4,5,6, reparo de DNA ^7,8, biogênese do ribossomo ^9,10,11 e regulação da heterocromatina^12,13. A regulação dos corpos nucleares se ajusta às dimensões espaciais e temporais para acomodar as necessidades celulares, guiada pelos princípios de separação de fases^14,15. Consequentemente, esses corpos funcionam como fábricas transitórias onde os componentes funcionais se montam e se desmontam, sofrendo mudanças de tamanho e distribuição espacial. Portanto, entender as características das proteínas nucleares por microscopia, incluindo sua propensão a formar corpos e seu arranjo espacial em diferentes condições celulares, oferece informações valiosas sobre seus papéis funcionais. A microscopia de fluorescência é um método amplamente utilizado para o estudo de proteínas nucleares, permitindo sua detecção por meio de anticorpos fluorescentes ou expressando diretamente alvos com um repórter de proteína fluorescente^16,17.

Nesse contexto, os corpos nucleares aparecem como focos ou pontos brilhantes, com notável grau de esfericidade, tornando-os facilmente distinguíveis do ambiente circundante^16,18. Técnicas de super-resolução como STORM e PALM, ao fornecer resolução aprimorada (até 10 nm) ¹⁹, permitem uma caracterização mais precisa da estrutura e composição de condensados específicos²⁰ . No entanto, sua acessibilidade é limitada pelas despesas com equipamentos e pelas habilidades especializadas necessárias para a análise de dados. Portanto, a microscopia confocal continua popular devido ao seu equilíbrio favorável entre resolução e uso mais amplo. Essa popularidade é facilitada pela remoção inerente da luz fora de foco, o que diminui a necessidade de extensos procedimentos de pós-processamento para segmentação precisa, sua ampla disponibilidade em institutos de pesquisa, seu tempo efetivo de aquisição e preparação de amostras que normalmente é eficiente. No entanto, medir com precisão a distribuição, montagem ou difusão de proteínas usando ensaios de imunofluorescência em diversas condições celulares apresenta desafios, pois muitos métodos existentes carecem de orientação sobre a seleção de parâmetros adequados para proteínas com padrões de distribuição variados²¹. Além disso, lidar com o grande volume de dados resultante pode ser assustador para usuários com experiência limitada em análise de dados, comprometendo potencialmente o significado biológico dos resultados.

Para enfrentar esses desafios, introduzimos um protocolo passo a passo detalhado para preparação de imunofluorescência e análise de dados, com o objetivo de fornecer um método imparcial para quantificar a coloração de proteínas com vários padrões de organização (Figura 1). Este pipeline semiautomatizado foi projetado para usuários com experiência limitada em análise computacional e de imagem. Ele combina as funcionalidades de dois plug-ins estabelecidos em Fiji: FindFoci²² e 3D suite²³. Ao integrar a capacidade precisa de identificação de focos do FindFoci com os recursos de identificação e segmentação de objetos no espaço 3D oferecidos pelo 3D suite, nossa abordagem gera dois arquivos CSV por canal para cada campo de aquisição. Esses arquivos contêm informações complementares que facilitam o cálculo de métricas adequadas para vários tipos de distribuição de sinal, como a contagem de focos por célula, a distância dos focos do centróide nuclear e o coeficiente de heterogeneidade (IC), que introduzimos para a coloração difusa de proteínas. Além disso, reconhecemos que a extrapolação de dados pode ser demorada para usuários com habilidades limitadas de manuseio de dados. Para agilizar esse processo, fornecemos um script Python que compila automaticamente todas as medidas coletadas em um único arquivo para cada experimento. Os usuários podem executar este script sem a necessidade de instalar nenhum software de linguagem de programação. Disponibilizamos um código executável no Google Colab, uma plataforma baseada em nuvem que permite a escrita de scripts Python diretamente no navegador. Isso garante que nosso método seja intuitivo e prontamente acessível para uso imediato.

Demonstramos a eficácia do nosso protocolo na análise e quantificação de alterações na distribuição de sinal de duas proteínas nucleares: proteína 4 contendo bromodomínio (BRD4) e supressor de zeste-12 (SUZ12). BRD4 é uma proteína coativadora bem documentada dentro do complexo Mediador conhecida por formar condensados associados à iniciação transcricional dependente da polimerase II^24,25. SUZ12 é um componente proteico do Complexo Repressivo Polycomb 2 (PRC2) responsável por regular a deposição da modificação da histona H3K27me3^26,27. Essas proteínas exibem padrões diferentes dentro de dois tipos distintos de células: células T CD4⁺ virgens humanas recém-isoladas, que são quiescentes e exibem taxas lentas de atividade transcricional, e células T_H1 CD4⁺ diferenciadas in vitro, que são células efetoras especializadas em proliferação mostrando transcrição aumentada²⁸.