用于分析各种细胞类型中核体动态变化的多功能管道

真核生物基因组的组织由多层表观遗传修饰¹ 控制，协调可能发生在称为核体或凝聚物² 的特殊隔室中的几种核功能。在这些结构中，发生转录起始³、RNA 加工 ^4,5,6、DNA 修复 ^7,8、核糖体生物发生^9、10、¹¹ 和异染色质调节^12,13 等过程。在相分离原理的指导下，核体的调节在空间和时间维度上进行调整，以适应细胞需求^14,15。因此，这些物体充当了瞬态工厂的功能，功能组件在这里组装和拆卸，大小和空间分布发生变化。因此，通过显微镜了解核蛋白的特性，包括它们形成体的倾向及其在不同细胞条件下的空间排列，为了解它们的功能作用提供了有价值的见解。荧光显微镜检查是一种广泛用于研究核蛋白的方法，可通过荧光抗体检测核蛋白，或使用荧光蛋白报告基因直接表达靶标^16,17。

在这种情况下，核体表现为明亮的焦点或点状，具有显着的球形度，使其很容易与周围环境区分开^{来 16,18}。STORM 和 PALM 等超分辨率技术通过提供更高的分辨率（高达 10 nm）¹⁹，能够更精确地表征特定凝聚物的结构和组成²⁰。然而，它们的可访问性受到设备费用和数据分析所需专业技能的限制。因此，共聚焦显微镜仍然很受欢迎，因为它在分辨率和更广泛的使用之间取得了良好的平衡。这种流行是由于固有的离焦光去除，这减少了对精确分割的广泛后处理程序的要求、它在研究机构中的广泛可用性、有效的采集时间以及通常高效的样品制备。然而，使用免疫荧光检测在不同细胞条件下准确测量蛋白质分布、组装或扩散带来了挑战，因为许多现有方法缺乏为具有不同分布模式的蛋白质选择合适的参数的指导²¹。此外，对于数据分析经验有限的用户来说，处理产生的大量数据可能会令人生畏，这可能会损害结果的生物学意义。

为了应对这些挑战，我们引入了免疫荧光制备和数据分析的详细分步方案，旨在提供一种无偏的方法来量化具有各种组织模式的蛋白质染色（图 1）。此半自动管道专为计算和成像分析专业知识有限的用户而设计。它结合了两个成熟的斐济插件的功能：FindFoci²² 和 3D suite²³。通过将 FindFoci 的精确焦点识别功能与 3D 套件提供的 3D 空间中的对象识别和分割功能集成，我们的方法为每个采集区域的每个通道生成两个 CSV 文件。这些文件包含补充信息，有助于计算适用于各种类型信号分布的指标，例如每个细胞的病灶计数、病灶与核质心的距离以及我们引入的用于弥散蛋白染色的不均匀系数 （IC）。此外，我们承认，对于数据处理技能有限的用户来说，数据外推可能非常耗时。为了简化此过程，我们提供了一个 Python 脚本，该脚本可自动将每个实验的所有收集的测量值编译到一个文件中。用户无需安装任何编程语言软件即可执行此脚本。我们在 Google Colab 上提供了可执行代码，这是一个基于云的平台，允许直接在浏览器中编写 Python 脚本。这确保了我们的方法直观且易于立即使用。

我们证明了我们的方案在分析和量化两种核蛋白信号分布改变方面的有效性：含溴结构域的蛋白 4 （BRD4） 和 zeste-12 抑制因子 （SUZ12）。BRD4 是 Mediator 复合体中一种有据可查的共激活因子蛋白，已知可形成与聚合酶 II 依赖性转录起始相关的缩合物^24,25。SUZ12 是多梳抑制复合物 2 （PRC2） 的蛋白质组分，负责调节 H3K27me3 组蛋白修饰的沉积^26,27。这些蛋白质在两种不同的细胞类型中表现出不同的模式：新鲜分离的人 CD4⁺ 幼稚 T 细胞，它们是静止的，转录活性速度较慢，以及体外分化的 T_H1 CD4⁺ 细胞，它们是特化的增殖效应细胞，显示转录增加²⁸。