Eine vielseitige Pipeline für die Analyse dynamischer Veränderungen in Kernkörpern in einer Vielzahl von Zelltypen

Die Organisation des eukaryotischen Genoms wird durch mehrere Schichten epigenetischer Modifikationen¹ gesteuert, die mehrere Kernfunktionen koordinieren, die in spezialisierten Kompartimenten, den sogenannten Kernkörpern oder Kondensaten, ablaufen können². Innerhalb dieser Strukturen finden Prozesse wie die Transkriptionsinitiierung³, die RNA-Prozessierung ^4,5,6, die DNA-Reparatur ^7,8, die Ribosomenbiogenese ^9,10,11 und die Heterochromatinregulation^12,13 statt. Die Regulation von Kernkörpern passt sich sowohl in räumlicher als auch in zeitlicher Hinsicht an die zellulären Anforderungen an, geleitet von den Prinzipien der Phasentrennung^14,15. Folglich fungieren diese Körper als vergängliche Fabriken, in denen funktionale Komponenten zusammen- und zerlegt werden und sich in Größe und räumlicher Verteilung ändern. Daher bietet das Verständnis der Eigenschaften von Kernproteinen durch Mikroskopie, einschließlich ihrer Neigung zur Körperbildung und ihrer räumlichen Anordnung unter verschiedenen zellulären Bedingungen, wertvolle Einblicke in ihre funktionelle Rolle. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von Kernproteinen, die ihren Nachweis durch fluoreszierende Antikörper oder die direkte Expression von Zielen mit einem fluoreszierenden Proteinreporter ermöglicht^16,17.

In diesem Zusammenhang erscheinen Kernkörper als helle Brennpunkte oder Puncta mit einem bemerkenswerten Grad an Sphärizität, wodurch sie leicht von der umgebenden Umgebung unterscheidbar sind^16,18. Superauflösungstechniken wie STORM und PALM ermöglichen durch ihre verbesserte Auflösung (bis zu 10 nm)¹⁹ eine genauere Charakterisierung der Struktur und Zusammensetzung spezifischer Kondensate²⁰. Ihre Zugänglichkeit ist jedoch durch die Kosten für die Ausrüstung und die für die Datenanalyse erforderlichen Fachkenntnisse eingeschränkt. Daher ist die konfokale Mikroskopie aufgrund ihres günstigen Gleichgewichts zwischen Auflösung und breiterer Verwendung nach wie vor beliebt. Diese Popularität wird durch die inhärente Entfernung von unscharfem Licht erleichtert, wodurch der Bedarf an umfangreichen Nachbearbeitungsverfahren für eine genaue Segmentierung verringert wird, durch seine weit verbreitete Verfügbarkeit in Forschungsinstituten, durch seine effektive Erfassungszeit und durch eine in der Regel effiziente Probenvorbereitung. Die genaue Messung der Proteinverteilung, -assemblierung oder -diffusion mit Immunfluoreszenz-Assays unter verschiedenen zellulären Bedingungen stellt jedoch eine Herausforderung dar, da vielen bestehenden Methoden eine Anleitung zur Auswahl geeigneter Parameter für Proteine mit unterschiedlichen Verteilungsmustern fehlt²¹. Darüber hinaus kann der Umgang mit dem daraus resultierenden großen Datenvolumen für Benutzer mit begrenzter Erfahrung in der Datenanalyse entmutigend sein, was die biologische Bedeutung der Ergebnisse beeinträchtigen kann.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, stellen wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Immunfluoreszenzvorbereitung und Datenanalyse vor, das darauf abzielt, eine unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung der Proteinfärbung mit verschiedenen Organisationsmustern bereitzustellen (Abbildung 1). Diese halbautomatische Pipeline wurde für Benutzer mit begrenztem Fachwissen in der Computer- und Bildgebungsanalyse entwickelt. Es kombiniert die Funktionalitäten von zwei etablierten Fiji-Plugins: FindFoci²² und 3D Suite²³. Durch die Integration der präzisen Foki-Identifikationsfunktion von FindFoci mit den Objektidentifikations- und Segmentierungsfunktionen im 3D-Raum, die von der 3D Suite angeboten werden, generiert unser Ansatz zwei CSV-Dateien pro Kanal für jeden Erfassungsbereich. Diese Dateien enthalten ergänzende Informationen, die die Berechnung von Metriken erleichtern, die für verschiedene Arten der Signalverteilung geeignet sind, wie z. B. die Anzahl der Herde pro Zelle, den Abstand der Brennpunkte vom Kernschwerpunkt und den Inhomogenitätskoeffizienten (IC), den wir für die diffuse Proteinfärbung eingeführt haben. Darüber hinaus erkennen wir an, dass die Datenextrapolation für Benutzer mit begrenzten Fähigkeiten im Umgang mit Daten zeitaufwändig sein kann. Um diesen Prozess zu optimieren, stellen wir ein Python-Skript zur Verfügung, das alle gesammelten Messungen automatisch in einer einzigen Datei für jedes Experiment zusammenfasst. Benutzer können dieses Skript ausführen, ohne eine Programmiersprachensoftware installieren zu müssen. Wir stellen einen ausführbaren Code auf Google Colab zur Verfügung, einer Cloud-basierten Plattform, die das Schreiben von Python-Skripten direkt im Browser ermöglicht. Dadurch wird sichergestellt, dass unsere Methode intuitiv und für den sofortigen Einsatz leicht zugänglich ist.

Wir demonstrieren die Wirksamkeit unseres Protokolls bei der Analyse und Quantifizierung von Veränderungen in der Signalverteilung von zwei nukleären Proteinen: dem Bromodomänen-haltigen Protein 4 (BRD4) und dem Suppressor von Zeste-12 (SUZ12). BRD4 ist ein gut dokumentiertes Koaktivatorprotein innerhalb des Mediator-Komplexes, von dem bekannt ist, dass es Kondensate bildet, die mit der Polymerase II-abhängigen transkriptionellen Initiation assoziiert sind^24,25. SUZ12 ist eine Proteinkomponente des Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), der für die Regulierung der Ablagerung der H3K27me3-Histonmodifikation verantwortlich ist^26,27. Diese Proteine weisen unterschiedliche Muster innerhalb von zwei verschiedenen Zelltypen auf: frisch isolierte humane CD4⁺-naive T-Zellen, die ruhen und eine langsame Transkriptionsaktivität aufweisen, und in vitro differenzierte T_H1 CD4⁺-Zellen, bei denen es sich um spezialisierte, proliferierende Effektorzellen handelt, die eine erhöhte Transkription aufweisen²⁸.