Un pipeline polyvalent pour l’analyse des changements dynamiques dans les corps nucléaires dans une variété de types de cellules

L’organisation du génome eucaryote est régie par de multiples couches de modifications épigénétiques¹, coordonnant plusieurs fonctions nucléaires qui peuvent se produire dans des compartiments spécialisés appelés corps nucléaires ou condensats². Au sein de ces structures, des processus tels que l’initiation de la transcription³, le traitement de l’ARN ^4,5,6, la réparation de l’ADN ^7,8, la biogenèse des ribosomes ^9,10,11 et la régulation de l’hétérochromatine^12,13 ont lieu. La régulation des corps nucléaires s’ajuste sur les dimensions spatiales et temporelles pour répondre aux besoins cellulaires, guidée par les principes de séparation de phase^14,15. Par conséquent, ces corps fonctionnent comme des usines transitoires où les composants fonctionnels s’assemblent et se désassemblent, subissant des changements de taille et de distribution spatiale. Par conséquent, la compréhension des caractéristiques des protéines nucléaires par microscopie, y compris leur propension à former des corps et leur arrangement spatial dans différentes conditions cellulaires, offre des informations précieuses sur leurs rôles fonctionnels. La microscopie à fluorescence est une méthode largement utilisée pour étudier les protéines nucléaires, permettant leur détection à l’aide d’anticorps fluorescents ou exprimant directement des cibles avec un rapporteur de protéines fluorescentes^16,17.

Dans ce contexte, les corps nucléaires apparaissent comme des foyers brillants ou puncta, avec un degré notable de sphéricité, ce qui les rend facilement distinguables de l’environnement environnant^16,18. Les techniques de super-résolution telles que STORM et PALM, en offrant une résolution améliorée (jusqu’à 10 nm)¹⁹, permettent une caractérisation plus précise de la structure et de la composition de condensats^{spécifiques20}. Cependant, leur accessibilité est limitée par les dépenses d’équipement et les compétences spécialisées nécessaires à l’analyse des données. Par conséquent, la microscopie confocale reste populaire en raison de son équilibre favorable entre la résolution et une utilisation plus large. Cette popularité est facilitée par la suppression inhérente de la lumière floue, ce qui réduit la nécessité de procédures de post-traitement étendues pour une segmentation précise, sa disponibilité généralisée dans les instituts de recherche, son temps d’acquisition effectif et sa préparation d’échantillons qui est généralement efficace. Cependant, la mesure précise de la distribution, de l’assemblage ou de la diffusion des protéines à l’aide de tests d’immunofluorescence dans diverses conditions cellulaires pose des défis, car de nombreuses méthodes existantes manquent de conseils sur la sélection de paramètres appropriés pour les protéines ayant des modèles de distribution variables²¹. De plus, la gestion du grand volume de données qui en résulte peut être intimidante pour les utilisateurs ayant une expérience limitée de l’analyse des données, ce qui peut compromettre la signification biologique des résultats.

Pour relever ces défis, nous introduisons un protocole détaillé étape par étape pour la préparation de l’immunofluorescence et l’analyse des données, visant à fournir une méthode non biaisée pour quantifier la coloration des protéines avec divers modèles d’organisation (Figure 1). Ce pipeline semi-automatisé est conçu pour les utilisateurs ayant une expertise limitée en analyse informatique et d’imagerie. Il combine les fonctionnalités de deux plugins fidjiens établis : FindFoci²² et 3D suite²³. En intégrant la capacité d’identification précise des foyers de FindFoci aux fonctionnalités d’identification et de segmentation d’objets dans l’espace 3D offertes par 3D suite, notre approche génère deux fichiers CSV par canal pour chaque champ d’acquisition. Ces fichiers contiennent des informations complémentaires qui facilitent le calcul de métriques adaptées à divers types de distribution de signaux, telles que le nombre de foyers par cellule, la distance des foyers par rapport au centroïde nucléaire et le coefficient d’inhomogénéité (CI), que nous avons introduit pour la coloration diffuse des protéines. En outre, nous reconnaissons que l’extrapolation des données peut prendre beaucoup de temps pour les utilisateurs ayant des compétences limitées en matière de traitement des données. Pour rationaliser ce processus, nous fournissons un script Python qui compile automatiquement toutes les mesures collectées dans un seul fichier pour chaque expérience. Les utilisateurs peuvent exécuter ce script sans avoir besoin d’installer un logiciel de langage de programmation. Nous fournissons un code exécutable sur Google Colab, une plate-forme basée sur le cloud qui permet d’écrire des scripts Python directement dans le navigateur. Cela garantit que notre méthode est intuitive et facilement accessible pour une utilisation immédiate.

Nous démontrons l’efficacité de notre protocole dans l’analyse et la quantification des altérations de la distribution du signal de deux protéines nucléaires : la protéine 4 contenant le bromodomaine (BRD4) et le suppresseur de zeste-12 (SUZ12). BRD4 est une protéine coactivatrice bien documentée au sein du complexe Mediator connue pour former des condensats associés à l’initiation transcriptionnelle dépendante de la polymérase II^24,25. SUZ12 est un composant protéique du complexe répressif Polycomb 2 (PRC2) responsable de la régulation du dépôt de la modification^des histones H3K27me3 ^26,27. Ces protéines présentent des motifs différents au sein de deux types de cellules distincts : les lymphocytes T humains CD4⁺ naïfs fraîchement isolés, qui sont quiescents et présentent des taux d’activité transcriptionnelle lents, et les cellules T_H1 CD4⁺ différenciées in vitro, qui sont des cellules effectrices proliférantes spécialisées présentant une transcription accrue²⁸.