Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

L’organizzazione del genoma eucariotico è governata da più strati di modificazioni epigenetiche¹, coordinando diverse funzioni nucleari che possono verificarsi all’interno di compartimenti specializzati chiamati corpi nucleari o condensati². All’interno di queste strutture, avvengono processi come l’inizio della trascrizione³, l’elaborazione dell’RNA ^4,5,6, la riparazione del DNA ^7,8, la biogenesi dei ribosomi ^9,10,11 e la regolazione dell’eterocromatina^12,13. La regolazione dei corpi nucleari si adatta sia alle dimensioni spaziali che temporali per soddisfare le esigenze cellulari, guidata dai principi della separazione di fase^14,15. Di conseguenza, questi corpi funzionano come fabbriche transitorie in cui i componenti funzionali si assemblano e si smontano, subendo cambiamenti nelle dimensioni e nella distribuzione spaziale. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche delle proteine nucleari al microscopio, compresa la loro propensione a formare corpi e la loro disposizione spaziale in diverse condizioni cellulari, offre preziose informazioni sui loro ruoli funzionali. La microscopia a fluorescenza è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio delle proteine nucleari, consentendo la loro rilevazione attraverso anticorpi fluorescenti o esprimendo direttamente bersagli con un reporter di proteine fluorescenti^16,17.

In questo contesto, i corpi nucleari appaiono come focolai luminosi o punti, con un notevole grado di sfericità, che li rende facilmente distinguibili dall’ambiente circostante^16,18. Tecniche di super-risoluzione come STORM e PALM, fornendo una risoluzione migliorata (fino a 10 nm)¹⁹, consentono una caratterizzazione più precisa della struttura e della composizione di specifici condensati²⁰. Tuttavia, la loro accessibilità è limitata dalle spese per le attrezzature e dalle competenze specialistiche necessarie per l’analisi dei dati. Pertanto, la microscopia confocale rimane popolare grazie al suo favorevole equilibrio tra risoluzione e utilizzo più ampio. Tale popolarità è facilitata dalla rimozione intrinseca della luce sfocata, che riduce la necessità di ampie procedure di post-elaborazione per una segmentazione accurata, la sua ampia disponibilità negli istituti di ricerca, il suo tempo di acquisizione effettivo e la preparazione del campione che è tipicamente efficiente. Tuttavia, la misurazione accurata della distribuzione, dell’assemblaggio o della diffusione delle proteine utilizzando saggi di immunofluorescenza in diverse condizioni cellulari pone delle sfide, poiché molti metodi esistenti non forniscono indicazioni sulla selezione di parametri adeguati per proteine con modelli di distribuzione variabili²¹. Inoltre, la gestione del grande volume di dati risultante può essere scoraggiante per gli utenti con esperienza limitata nell’analisi dei dati, compromettendo potenzialmente il significato biologico dei risultati.

Per affrontare queste sfide, introduciamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione dell’immunofluorescenza e l’analisi dei dati, con l’obiettivo di fornire un metodo imparziale per quantificare la colorazione delle proteine con vari modelli di organizzazione (Figura 1). Questa pipeline semi-automatizzata è progettata per utenti con competenze limitate nell’analisi computazionale e di imaging. Combina le funzionalità di due affermati plug-in delle Fiji: FindFoci²² e 3D suite²³. Integrando la capacità di identificazione precisa dei punti focali di FindFoci con le funzionalità di identificazione e segmentazione degli oggetti nello spazio 3D offerte dalla suite 3D, il nostro approccio genera due file CSV per canale per ogni campo di acquisizione. Questi file contengono informazioni complementari che facilitano il calcolo di metriche adatte a vari tipi di distribuzione del segnale, come il conteggio dei focolai per cellula, la distanza dei focolai dal centroide nucleare e il coefficiente di disomogeneità (IC), che abbiamo introdotto per la colorazione diffusa delle proteine. Inoltre, riconosciamo che l’estrapolazione dei dati può richiedere molto tempo per gli utenti con limitate capacità di gestione dei dati. Per semplificare questo processo, forniamo uno script Python che compila automaticamente tutte le misurazioni raccolte in un unico file per ogni esperimento. Gli utenti possono eseguire questo script senza la necessità di installare alcun software di linguaggio di programmazione. Forniamo un codice eseguibile su Google Colab, una piattaforma basata su cloud che permette la scrittura di script Python direttamente nel browser. Ciò garantisce che il nostro metodo sia intuitivo e facilmente accessibile per un uso immediato.

Dimostriamo l’efficacia del nostro protocollo nell’analizzare e quantificare le alterazioni nella distribuzione del segnale di due proteine nucleari: la proteina 4 contenente il bromodominio (BRD4) e il soppressore di zeste-12 (SUZ12). BRD4 è una proteina coattivatrice ben documentata all’interno del complesso mediatore nota per formare condensati associati all’inizio trascrizionale dipendente dalla polimerasi II^24,25. SUZ12 è un componente proteico del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsabile della regolazione della deposizione della modificazione istonica H3K27me3^26,27. Queste proteine mostrano modelli diversi all’interno di due tipi cellulari distinti: le cellule T umane CD4⁺ naive appena isolate, che sono quiescenti e mostrano bassi tassi di attività trascrizionale, e le cellule T_H1 CD4⁺ differenziate in vitro, che sono cellule effettrici specializzate e proliferanti che mostrano un aumento della trascrizione²⁸.