Универсальный конвейер для анализа динамических изменений в ядерных телах в различных типах клеток

Организация эукариотического генома регулируется несколькими слоями эпигенетических модификаций¹, координирующих несколько ядерных функций, которые могут происходить в специализированных отсеках, называемых ядерными телами или конденсатами². В этих структурах происходят такие процессы, как инициация транскрипции³, процессинг РНК ^4,5,6, репарация ДНК ^7,8, биогенез рибосом ^9,10,11 и регуляция гетерохроматина ^12,13. Регуляция ядерных тел корректируется как в пространственном, так и во временном измерениях, чтобы удовлетворить потребности клеток, руководствуясь принципами разделения фаз^14,15. Следовательно, эти тела функционируют как переходные фабрики, где функциональные компоненты собираются и разбираются, претерпевая изменения в размерах и пространственном распределении. Таким образом, понимание характеристик ядерных белков с помощью микроскопии, включая их склонность к образованию тел и их пространственное расположение в различных клеточных условиях, дает ценную информацию об их функциональных ролях. Флуоресцентная микроскопия является широко используемым методом изучения ядерных белков, позволяющим обнаруживать их с помощью флуоресцентных антител или непосредственно экспрессировать мишени с помощью флуоресцентного белка-репортера^16,17.

В этом контексте ядерные тела предстают в виде ярких очагов или точек, с заметной степенью сферичности, что делает их легко отличимыми от^{окружающей среды.} Методы сверхвысокого разрешения, такие как STORM и PALM, обеспечивая улучшенное разрешение (до 10 нм)¹⁹, позволяют более точно характеризовать структуру и состав конкретных^{конденсатов20}. Однако их доступность ограничена затратами на оборудование и специальными навыками, необходимыми для анализа данных. Таким образом, конфокальная микроскопия остается популярной благодаря выгодному балансу между разрешением и более широким использованием. Такой популярности способствует неизбежное удаление расфокусированного света, что снижает потребность в обширных процедурах постобработки для точной сегментации, его широкой доступности в научно-исследовательских институтах, эффективном времени получения и обычно эффективной подготовке образцов. Тем не менее, точное измерение распределения, сборки или диффузии белка с помощью иммунофлуоресцентных анализов в различных клеточных условиях представляет собой проблему, поскольку во многих существующих методах отсутствуют рекомендации по выбору подходящих параметров для белков с различными моделями распределения^. Кроме того, обработка большого объема данных может быть сложной задачей для пользователей с ограниченным опытом анализа данных, что может поставить под угрозу биологическую значимость результатов.

Для решения этих проблем мы представляем подробный пошаговый протокол подготовки иммунофлуоресценции и анализа данных, направленный на обеспечение объективного метода количественной оценки окрашивания белков с различными структурами организации (Рисунок 1). Этот полуавтоматический конвейер предназначен для пользователей с ограниченными знаниями в области вычислительного анализа и анализа изображений. Он сочетает в себе функции двух известных фиджийских плагинов: FindFoci²² и 3D suite²³. Благодаря интеграции возможностей точной идентификации очагов FindFoci с функциями идентификации объектов и сегментации в 3D-пространстве, предлагаемыми 3D Suite, наш подход генерирует два файла CSV на канал для каждой области приобретения. Эти файлы содержат дополнительную информацию, которая облегчает расчет метрик, подходящих для различных типов распределения сигналов, таких как количество очагов на ячейку, расстояние фокусов от ядерного центроида и коэффициент неоднородности (IC), который мы ввели для диффузного окрашивания белков. Кроме того, мы признаем, что экстраполяция данных может отнимать много времени у пользователей с ограниченными навыками работы с данными. Чтобы упростить этот процесс, мы предоставляем скрипт Python, который автоматически компилирует все собранные измерения в один файл для каждого эксперимента. Пользователи могут выполнять этот скрипт без необходимости установки какого-либо программного обеспечения на языке программирования. Мы предоставляем исполняемый код на Google Colab, облачной платформе, которая позволяет писать скрипты Python прямо в браузере. Это гарантирует, что наш метод интуитивно понятен и легко доступен для немедленного использования.

Мы демонстрируем эффективность нашего протокола в анализе и количественной оценке изменений в распределении сигнала двух ядерных белков: бромдомен-содержащего белка 4 (BRD4) и супрессора zeste-12 (SUZ12). BRD4 является хорошо документированным белком-коактиватором в составе медиаторного комплекса, который, как известно, образует конденсаты^, связанные с полимеразой II-зависимой инициацией транскрипции^24,25. SUZ12 является белковым компонентом репрессивного комплекса Polycomb 2 (PRC2), отвечающего за регуляцию отложения гистона H3K27me3 модификации^26,27. Эти белки демонстрируют различные паттерны в двух различных типах клеток: свежевыделенные человеческие CD4⁺ наивные Т-клетки, которые находятся в состоянии покоя и демонстрируют медленную скорость транскрипционной активности, и дифференцированные in vitro T_H1 CD4⁺ клетки, которые являются специализированными, пролиферирующими эффекторными клетками, демонстрирующими повышенную транскрипцию^.