さまざまな細胞タイプの原子核体の動的変化を解析するための汎用性の高いパイプライン
概要
この方法は、ヒトTリンパ球のさまざまな核組織パターンを持つタンパク質分布を評価するための免疫蛍光プロトコルと定量パイプラインを示しています。このプロトコルは、サンプル調製から始まり、フィジーでの半自動分析の実行まで、段階的なガイダンスを提供し、Google Colabノートブックによるデータ処理で終わります。
Abstract
転写制御などのさまざまな核プロセスは、免疫蛍光法によって識別可能な病巣として知られる個別の構造内で発生します。顕微鏡を用いて多様な細胞条件下でのこれらの病巣の動態を調査することで、細胞の同一性と機能を支配する分子メカニズムに関する貴重な洞察が得られます。しかし、異なる細胞タイプで免疫蛍光アッセイを実施し、これらの病巣の組み立て、拡散、分布の変化を評価するには、多くの課題があります。これらの課題には、サンプル調製の複雑さ、イメージングデータを解析するためのパラメータの決定、大量のデータの管理などが含まれます。さらに、既存のイメージングワークフローは、熟練したユーザー向けに調整されていることが多いため、より広範なオーディエンスへのアクセスが制限されています。
この研究では、さまざまなヒト初代T細胞タイプの核タンパク質を調査するために最適化された免疫蛍光プロトコルを導入し、関心のある任意のタンパク質と細胞タイプに合わせてカスタマイズできます。さらに、タンパク質染色が明確な病巣を形成するか、拡散した核分布を示すかにかかわらず、タンパク質染色を偏りなく定量する方法を提示します。
私たちが提案する方法は、Jythonで開発され、フィジーで実行可能な半自動パイプラインを活用して、細胞染色から分析までの包括的なガイドを提供します。さらに、データ管理を効率化するユーザーフレンドリーなPythonスクリプトを提供し、Google Colabノートブックで公開されています。私たちのアプローチは、さまざまな状況で多様な核組織化パターンを持つタンパク質の非常に有益な免疫蛍光分析を実現する有効性を実証しています。
Introduction
真核生物のゲノムの組織化は、エピジェネティックな修飾1の複数の層によって支配されており、核体または凝縮物2と呼ばれる特殊なコンパートメント内で発生する可能性のあるいくつかの核機能を調整しています。これらの構造内では、転写開始3、RNAプロセシング4,5,6、DNA修復7,8、リボソーム生合成9,10,11、ヘテロクロマチン制御12,13などのプロセスが進行します。核体の調節は、相分離の原理14,15に導かれて、細胞の要件に対応するために空間的および時間的次元の両方で調整されます。その結果、これらの物体は、機能部品が組み立てられ、分解され、サイズや空間分布が変化する過渡的な工場として機能します。したがって、核タンパク質の特性(体を形成する傾向やさまざまな細胞条件での空間配置など)を顕微鏡で理解することは、その機能的役割に関する貴重な洞察を提供します。蛍光顕微鏡法は、核タンパク質を研究するために広く使用されている方法であり、蛍光抗体を介してそれらを検出したり、蛍光タンパク質レポーター16,17で直接標的を発現させたりすることができる。
この文脈では、核体は明るい病巣またはプンクタとして現れ、顕著な程度の球形性を伴い、周囲の環境と容易に区別できる16,18。STORMやPALMのような超解像技術は、分解能の向上(最大10nm)19を提供することにより、特定の凝縮物20の構造と組成のより正確な特性評価を可能にする。しかし、その利用可能性は、設備費やデータ分析に必要な専門スキルによって制限されています。したがって、共焦点顕微鏡は、分解能と幅広い使用との間の良好なバランスにより、依然として人気があります。このような人気は、焦点が合っていない光を本質的に除去することで、正確なセグメンテーションのための広範な後処理手順の必要性が減少し、研究機関で広く利用可能になり、効果的な取得時間、および一般的に効率的なサンプル調製によって促進されます。しかし、免疫蛍光アッセイを用いて多様な細胞条件でタンパク質の分布、アセンブリ、または拡散を正確に測定することは、多くの既存の方法がさまざまな分布パターンを持つタンパク質に適したパラメータを選択するためのガイダンスを欠いているため、課題を提起します21。さらに、結果として生じる大量のデータを処理することは、データ分析の経験が限られているユーザーにとっては困難であり、結果の生物学的意義を損なう可能性があります。
これらの課題に対処するために、免疫蛍光法の調製とデータ解析のための詳細なステップバイステップのプロトコールを導入し、さまざまな組織パターンでタンパク質染色を偏りなく定量する方法を提供することを目指しています(図1)。この半自動パイプラインは、計算解析とイメージング解析の専門知識が限られているユーザー向けに設計されています。これは、2つの確立されたフィジープラグイン、FindFoci22 と3Dスイート23の機能を組み合わせたものです。FindFociの正確な病巣識別機能と、3Dスイートが提供する3D空間のオブジェクト識別およびセグメンテーション機能を統合することにより、私たちのアプローチは、取得フィールドごとにチャネルごとに2つのCSVファイルを生成します。これらのファイルには、細胞あたりの病巣数、核重心からの病巣の距離、びまん性タンパク質染色に導入した不均一性係数(IC)など、さまざまなタイプのシグナル分布に適したメトリクスの計算を容易にする補完的な情報が含まれています。さらに、データ外挿は、データ処理スキルが限られているユーザーにとって時間がかかる可能性があることを認識しています。このプロセスを効率化するために、各実験で収集されたすべての測定値を1つのファイルに自動的にコンパイルするPythonスクリプトを提供しています。ユーザーは、プログラミング言語ソフトウェアをインストールしなくても、このスクリプトを実行できます。Google Colabは、ブラウザで直接Pythonスクリプトを記述できるクラウドベースのプラットフォームであるGoogle Colabで実行可能コードを提供しています。これにより、当社の方法は直感的で、すぐに使用できるものとなっています。
私たちは、ブロモドメイン含有タンパク質4(BRD4)とゼステ-12のサプレッサー(SUZ12)の2つの核タンパク質のシグナル分布の変化を分析および定量化する上で、私たちのプロトコルの有効性を実証しています。BRD4は、ポリメラーゼII依存性転写開始24,25に関連する凝縮物を形成することが知られているメディエーター複合体内の十分に文書化されたコアクチベータータンパク質です。SUZ12は、H3K27me3ヒストン修飾26,27の沈着を制御する役割を担うポリコーム抑制複合体2(PRC2)のタンパク質成分である。これらのタンパク質は、2つの異なる細胞型内で異なるパターンを示します:静止状態で転写活性の速度が遅い、新たに単離されたヒトCD4+ナイーブT細胞と、転写の増加を示す特殊な増殖エフェクター細胞であるin vitro分化TH1 CD4+細胞です28。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ヒトTリンパ球の核タンパク質に対する免疫蛍光実験を行う方法を紹介します。この方法は、前述のように、固定および透過化ステップのわずかな変更を通じて、さまざまな細胞タイプで使用するための柔軟性を提供します30,31。
当社のイメージングワークフローは、文献、特にFindFociと3D Suite22,23…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、INGMイメージング施設、特にC.コルディリエーリとA.ファシアーニ、特にINGM FACSソーティング施設、特にM.Cクロスティ(Istituto Nazionale di Genetica Molecolare ‘Romeo ed Enrica Invernizzi'(INGM)、ミラノ、イタリア)の科学的および技術的支援に感謝します。M. Giannaccari氏には、技術的な情報提供のサポートに感謝します。この研究は、F.M. Ricerca Finalizzata(助成金番号GR-2018-12365280)、Fondazione AIRC(助成金番号2022 27066)、Fondazione Cariplo(助成金番号2019-3416)、Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica(FRRB CP2_12/2018)、Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza(助成金番号G43C22002620007)、Progetti di Rilevante Interesse Nazionale(PRIN)(助成金番号2022PKF9S)からBへの助成金によって資金提供されました。B.
Materials
| 1.5 mL Safe-Lock Tubes | Eppendord | #0030121503 | Protocol section 1 |
| 10 mL Serological pipettes | VWR | #612-3700 | Protocol section 1 |
| 20 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2149P-HR | Protocol section 1 |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | #352070 | Protocol section 1 |
| 200 µL barrier pipette tip | Thermo Scientific | #2069-HR | Protocol section 1 |
| antifade solution – ProlongGlass – mountingmedia | Invitrogen | #P36984 | Step 1.3.12 |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | #A7030 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| CD4+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | #130-096-533 | Step 1.1.2. |
| DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | Cat#D1306 | Step 1.3.10. |
| Dry ice | Step 1.3.1. | ||
| Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead | Life Technologies | #1131D | magnetic beads step 1.1.4. |
| EtOH | Carlo Erba | #4146320 | Step 1.2.1.1. |
| FACSAria SORP | BD Bioscences | Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | #10270106 | Step 1.1.4 |
| FICOLL PAQUE PLUS | Euroclone | GEH17144003F32 | Step 1.1.1. |
| FIJI Version 2.14.0 | – | – | Protocol section 3 |
| Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H) | Electron Microscopy Sciences | #72298-13 | Step 1.2.1. |
| Glycerol | Sigma | #G5516 | Step 1.2.7-1.3.1. |
| Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Step 1.3.8. |
| HCl | Sigma | #320331 | Step 1.3.4. |
| human neutralizing anti-IL-4 | Miltenyi Biotec | Cat#130-095-753 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-12 | Miltenyi Biotec | Cat#130-096-704 | Step 1.1.4. |
| human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | Cat#130-097-744 | Step 1.1.4. |
| Leica TCS SP5 Confocal microscope | Leica Microsystems | – | Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2×. Frame size 1024×1024 pixel. |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | #11140035 | Step 1.1.4. |
| Microscope Slides | VWR | #631-1552 | Step 1.3.12. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone) | BD Bioscience | #557871 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone) | BD Bioscience | #552888 | Step 1.1.3. |
| Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone) | Miltenyi Biotec | #130-113-546 | Step 1.1.3. |
| Multiwell 24 well | Falcon | #353047 | Protocol section 1 |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | PCN5000 | Step 1.3.6., 1.3.8. |
| PBS | Life Technologies | #14190094 | Protocol section 1 |
| Penicillin/Streptomycin solution | Life Technologies | #15070063 | Step 1.1.4. |
| PFA | Sigma | #P6148 | Step 1.2.4. |
| poly-L-lysine | Sigma | #P8920 | 1.2.1. |
| Primary antibody – BRD4 | Abcam | #ab128874 | Step 1.3.6. |
| Primary antibody – SUZ12 | Cel Signalling | mAb #3737 | Step 1.3.6. |
| RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I | Life Technologies | #61870010 | Step 1.1.4. |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | #11360039 | Step 1.1.4. |
| Triton X-100 | Sigma | #T8787 | Step 1.2., 1.3. |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | Step 1.3. |
| Tweezers | – | – | Protocol section 1 |
参考文献
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