Een veelzijdige pijplijn voor het analyseren van dynamische veranderingen in kernlichamen in verschillende celtypen

De organisatie van het eukaryote genoom wordt beheerst door meerdere lagen van epigenetische modificaties¹, die verschillende nucleaire functies coördineren die kunnen voorkomen in gespecialiseerde compartimenten die nucleaire lichamen of condensaten worden genoemd². Binnen deze structuren vinden processen plaats zoals transcriptie-initiatie³, RNA-verwerking ^4,5,6, DNA-reparatie ^7,8, ribosoombiogenese ^9,10,11 en heterochromatineregulatie^12,13. De regulatie van nucleaire lichamen past zich aan zowel ruimtelijke als temporele dimensies aan om aan de cellulaire vereisten te voldoen, geleid door principes van fasescheiding^14,15. Bijgevolg functioneren deze lichamen als voorbijgaande fabrieken waar functionele componenten worden geassembleerd en gedemonteerd, waarbij veranderingen in grootte en ruimtelijke verdeling worden ondergaan. Daarom biedt het begrijpen van de kenmerken van nucleaire eiwitten door microscopie, inclusief hun neiging om lichamen te vormen en hun ruimtelijke rangschikking in verschillende cellulaire omstandigheden, waardevolle inzichten in hun functionele rollen. Fluorescentiemicroscopie is een veelgebruikte methode voor het bestuderen van nucleaire eiwitten, waardoor ze kunnen worden gedetecteerd door middel van fluorescerende antilichamen of door doelen direct tot expressie te brengen met een fluorescerende eiwitreporter^16,17.

In deze context verschijnen nucleaire lichamen als heldere brandpunten of puncta, met een opmerkelijke mate van bolvormigheid, waardoor ze gemakkelijk te onderscheiden zijn van de omgeving^16,18. Technieken met superresolutie, zoals STORM en PALM, zorgen voor een verbeterde resolutie (tot 10 nm)¹⁹ en maken een nauwkeurigere karakterisering van de structuur en samenstelling van specifieke condensaten mogelijk²⁰. Hun toegankelijkheid wordt echter beperkt door de kosten van apparatuur en de gespecialiseerde vaardigheden die nodig zijn voor data-analyse. Daarom blijft confocale microscopie populair vanwege de gunstige balans tussen resolutie en breder gebruik. Een dergelijke populariteit wordt mogelijk gemaakt door de inherente verwijdering van onscherp licht, waardoor er minder uitgebreide nabewerkingsprocedures nodig zijn voor nauwkeurige segmentatie, de wijdverbreide beschikbaarheid in onderzoeksinstituten, de effectieve acquisitietijd en de monstervoorbereiding die doorgaans efficiënt is. Het nauwkeurig meten van eiwitdistributie, -assemblage of -diffusie met behulp van immunofluorescentietests in diverse cellulaire omstandigheden brengt echter uitdagingen met zich mee, aangezien veel bestaande methoden geen richtlijnen bieden voor het selecteren van geschikte parameters voor eiwitten met verschillende distributiepatronen²¹. Bovendien kan het verwerken van het resulterende grote gegevensvolume ontmoedigend zijn voor gebruikers met beperkte ervaring in gegevensanalyse, waardoor de biologische betekenis van de resultaten mogelijk in gevaar komt.

Om deze uitdagingen aan te pakken, introduceren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor immunofluorescentievoorbereiding en data-analyse, met als doel een onbevooroordeelde methode te bieden voor het kwantificeren van eiwitkleuring met verschillende organisatiepatronen (Figuur 1). Deze semi-geautomatiseerde pijplijn is ontworpen voor gebruikers met beperkte expertise op het gebied van computationele en beeldvormingsanalyse. Het combineert de functionaliteiten van twee gevestigde Fiji-plug-ins: FindFoci²² en 3D suite²³. Door de nauwkeurige foci-identificatiemogelijkheid van FindFoci te integreren met de objectidentificatie- en segmentatiefuncties in de 3D-ruimte die worden aangeboden door 3D suite, genereert onze aanpak twee CSV-bestanden per kanaal voor elk acquisitiegebied. Deze bestanden bevatten aanvullende informatie die de berekening vergemakkelijkt van metrieken die geschikt zijn voor verschillende soorten signaaldistributie, zoals het aantal foci per cel, de afstand van foci tot het nucleaire zwaartepunt en de inhomogeniteitscoëfficiënt (IC), die we hebben geïntroduceerd voor diffuse eiwitkleuring. Bovendien erkennen we dat gegevensextrapolatie tijdrovend kan zijn voor gebruikers met beperkte vaardigheden op het gebied van gegevensverwerking. Om dit proces te stroomlijnen, bieden we een Python-script dat alle verzamelde metingen automatisch samenvoegt tot één bestand voor elk experiment. Gebruikers kunnen dit script uitvoeren zonder dat ze programmeertaalsoftware hoeven te installeren. We bieden een uitvoerbare code op Google Colab, een cloudgebaseerd platform waarmee Python-scripts rechtstreeks in de browser kunnen worden geschreven. Dit zorgt ervoor dat onze methode intuïtief en gemakkelijk toegankelijk is voor direct gebruik.

We demonstreren de effectiviteit van ons protocol bij het analyseren en kwantificeren van veranderingen in de signaalverdeling van twee nucleaire eiwitten: Bromodomein-bevattend eiwit 4 (BRD4) en Suppressor van zeste-12 (SUZ12). BRD4 is een goed gedocumenteerd coactivatoreiwit binnen het Mediator-complex waarvan bekend is dat het condensaten vormt die geassocieerd zijn met polymerase II-afhankelijke transcriptionele initiatie^24,25. SUZ12 is een eiwitcomponent van het Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) dat verantwoordelijk is voor het reguleren van de afzetting van H3K27me3 histonmodificatie^26,27. Deze eiwitten vertonen verschillende patronen binnen twee verschillende celtypen: vers geïsoleerde menselijke CD4^+-naïeve T-cellen, die in rust zijn en trage transcriptionele activiteit vertonen, en in vitro gedifferentieerde T_H1 CD4⁺-cellen, die gespecialiseerde, prolifererende effectorcellen zijn die een verhoogde transcriptie vertonen²⁸.