Экстракция молекул гликогена печени для определения структуры гликогена

Гликоген представляет собой сложный, гиперразветвленный полимер глюкозы, содержащийся в животных, грибах и бактериях¹. У млекопитающих гликоген печени функционирует как буфер глюкозы в крови, сохраняя гомеостаз, в то время как мышечный гликоген действует как кратковременный резервуар глюкозы, обеспечивая^{энергию напрямую.} Структуру гликогена часто описывают тремя уровнями (см. рис. 1): 1. Линейные цепи образуются мономерами глюкозы через гликозидные связи (1→4)-α, причем точки разветвления соединяются гликозидными связями (1→6)-α; 2. сильно разветвленные частицы β (~20 нм в диаметре), которые, особенно в таких тканях, как скелетные мышцы, действуют как независимые молекулы гликогена ^3,4; 3. Более крупные частицы гликогена α (до 300 нм в диаметре), состоящие из более мелких β единиц гликогена, которые обнаруживаются в печени⁵, сердце⁶ и у^{некоторых видов,} не относящихся к млекопитающим7. Частицы печеночных α от мышей с диабетом молекулярно хрупкие, со склонностью разлагаться до β-частиц при растворении в диметилсульфоксиде (ДМСО), в то время как частицы α из контрольной группы, не страдающей диабетом, обычно остаются неизменными. Одна из гипотез заключается в том, что эта хрупкость может усугубить плохой баланс глюкозы в крови, наблюдаемый при диабете, при этом хрупкие частицы α потенциально могут привести к более высоким долям более быстро разлагающихся частиц^β 8,9,10,11.

Традиционные методы экстракции гликогена используют относительно жесткие условия воздействия на ткани печени горячего щелочного раствора¹² или кислотных растворов, таких как трихлоруксусная кислота (ТСА)¹³ или хлорная кислота (РСА)¹⁴. Несмотря на то, что эти методы эффективны для отделения гликогена от других компонентов ткани печени, они неизбежно разрушают структуру гликогена в некоторой^{степени.} Хотя эти методы подходят для количественного измерения содержания гликогена, они не идеальны для исследований, ориентированных на получение структурной информации о гликогене из-за этого структурного повреждения. С момента разработки этих методов была разработана более мягкая процедура экстракции, в которой используется холодный буфер Tris (показано, что он ингибирует деградацию глюкозидазы) с ультрацентрифугированием градиента плотности сахарозы 17,18,19. При контролируемом pH ~8 этот метод не подвергает гликоген кислотному или щелочному гидролизу, наблюдаемому в предыдущих процедурах.

Ультрацентрифугирование градиента плотности сахарозы гомогенизированной ткани печени может отделить частицы гликогена от большей части клеточного материала. При необходимости дополнительную очистку можно выполнить препаративной эксклюзионной хроматографией, в результате которой получается сбор очищенного гликогена с присоединенными гликогенассоциирующими белками²⁰. Хотя этот метод, при более мягких условиях, с большей вероятностью сохраняет структуру гликогена, трудно предотвратить потерю некоторой части гликогена в надосадочной жидкости, особенно более мелких частиц гликогена, которые^{менее плотны}. Другая потенциальная причина потери гликогена заключается в том, что более мягкие условия допускают некоторую ферментативную деградацию, что приводит к более низкому выходу гликогена по сравнению с более жесткими методами экстракции. В недавних исследованиях сообщалось об оптимизации метода экстракции гликогена из печени для сохранения структуры гликогена²¹. Здесь были проверены различные концентрации сахарозы (30%, 50%, 72,5%), чтобы определить, минимизирует ли более низкая концентрация сахарозы потерю более мелких частиц гликогена. Обоснование заключалось в том, что более низкая плотность позволит более мелким, менее плотным частицам проникать в слой сахарозы и агрегировать в грануле с остальной частью гликогена.

В этом исследовании методы экстракции с 10-минутной стадией кипячения и без нее сравнивались, чтобы проверить, можно ли денатурировать ферменты деградации гликогена, что привело бы к извлечению большего количества гликогена, который также не подвергался частичному разложению. Для определения структуры экстрагированного гликогена использовали распределение целых молекул по размерам и распределение длины цепи гликогена, аналогично оптимизации экстракции крахмала, опубликованной ранее²². Методом размерной эксклюзионной хроматографии (SEC) с детектированием дифференциального показателя преломления (DRI) было получено распределение гликогена по размерам, которое описывает общую молекулярную массу в зависимости от размера молекулы. Для анализа распределений длины цепей, которые описывают относительное количество цепных цепей каждого заданного размера (или степени полимеризации), был использован электрофорез углеводов с помощью флуорофора (FACE). В данной работе описана методика извлечения гликогена из тканей печени на основе предыдущего оптимизационного исследования²¹. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее подходящим методом для сохранения структуры гликогена является концентрация сахарозы 30% с 10-минутной стадией кипячения.