글리코겐 구조 측정을 위한 간 글리코겐 분자 추출

글리코겐(Glycogen)은 동물, 곰팡이 및 박테리아에서 발견되는 포도당의 복잡한 과분지 중합체입니다¹. 포유류에서 간 글리코겐은 항상성을 보존하는 혈당 완충 역할을 하는 반면, 근육 글리코겐은 에너지를 직접 공급하는 단기 포도당 저장소 역할을 한다². 글리코겐의 구조는 종종 세 가지 수준으로 설명됩니다(그림 1 참조). 1. 선형 사슬은 (1→4)-α 글리코시드 결합을 통해 포도당 단량체에 의해 형성되며, 분기점은 (1→6)-α 글리코시드 결합을 통해 연결됩니다. 2. 특히 골격근과 같은 조직에서 독립적 인 글리코겐 분자 ^3,4로 작용하는 고도로 분지 된 β 입자 (직경 ~ 20 nm); 3. 더 작은 β 글리코겐 단위로 구성된 더 큰 α 글리코겐 입자(직경 300nm까지)는 간⁵, 심장⁶ 및 일부 비포유류 종⁷에서 발견된다. 당뇨병 마우스의 간 α 입자는 분자적으로 깨지기 쉬우며 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해될 때 β 입자로 분해되는 경향이 있는 반면, 비당뇨병 대조군의 α 입자는 일반적으로 변하지 않습니다. 한 가지 가설은 이러한 취약성이 당뇨병에서 볼 수 있는 열악한 혈당 균형을 악화시킬 수 있으며, 깨지기 쉬운 α 입자가 잠재적으로 더 빠르게 분해되는 β 입자 8,9,10,11의 비율을 높일 수 있다는 것입니다.

전통적인 글리코겐 추출 방법은 간 조직을 뜨거운 알칼리성 용액(¹²) 또는 트리클로로아세트산(TCA)¹³ 또는 과염소산(PCA)¹⁴과 같은 산 용액에 노출시키는 비교적 가혹한 조건을 이용합니다. 간 조직의 다른 성분에서 글리코겐을 분리하는 데 효과적이지만, 이러한 방법은 필연적으로 글리코겐 구조를 어느 정도 저하시킵니다^15,16. 이러한 방법은 글리코겐 함량의 정량적 측정에 적합하지만 이러한 구조적 손상으로 인해 글리코겐에 대한 구조적 정보를 얻는 데 중점을 둔 연구에는 적합하지 않습니다. 이러한 방법의 개발 이후, 슈크로스 밀도 구배 초원심분리 17,18,19와 함께 차가운 트리스 완충액(글루코시다제 분해를 억제하는 것으로 나타남)을 활용하는 보다 온화한 추출 절차가 개발되었다. pH가 ~8로 제어된 상태에서 이 방법은 글리코겐을 이전 절차에서 볼 수 있는 산 또는 알칼리성 가수분해에 노출시키지 않습니다.

균질화된 간 조직의 자당 밀도 구배 초원심분리는 대부분의 세포 물질에서 글리코겐 입자를 분리할 수 있습니다. 필요한 경우, 추가적인 정제는 제조용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있으며, 그 결과 부착된 글리코겐-결합 단백질(²⁰)과 함께 정제된 글리코겐을 수거할 수 있다. 이 방법은, 보다 온화한 조건에서, 글리코겐의 구조를 보존할 가능성이 더 높지만, 글리코겐의 일부가 상층액, 특히 밀도가 낮은 더 작은 글리코겐 입자에서 손실되는 것을 방지하기는 어렵다¹⁵. 글리코겐 손실의 또 다른 잠재적 원인은 온화한 조건에서 일부 효소 분해가 발생하여 더 가혹한 추출 방법에 비해 글리코겐 수율이 낮아진다는 것입니다. 최근 연구에서는 글리코겐²¹의 구조를 보존하기 위해 간-글리코겐 추출 방법을 최적화했다고 보고했습니다. 여기서, 다양한 슈크로스 농도(30%, 50%, 72.5%)를 시험하여 더 낮은 슈크로스 농도가 더 작은 글리코겐 입자의 손실을 최소화하는지 여부를 결정하였다. 그 근거는 밀도가 낮을수록 더 작고 밀도가 낮은 입자가 자당 층을 관통하여 나머지 글리코겐과 함께 펠릿에 응집될 수 있다는 것이었습니다.

이 연구에서는 글리코겐 분해 효소가 변성될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 10분 끓는 단계가 있는 추출 방법과 없는 추출 방법을 비교하여 부분 분해가 없는 더 많은 글리코겐을 추출했습니다. 추출된 글리코겐의 구조를 결정하기 위해 전체 분자 크기 분포 및 글리코겐 사슬 길이 분포를 사용했으며, 이는 이전에 발표된 전분 추출 최적화와 유사합니다²². 시차 굴절률(DRI) 검출 기능이 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 총 분자량을 분자 크기의 함수로 설명하는 글리코겐의 크기 분포를 얻었습니다. 형광단 보조 탄수화물 전기영동(FACE)을 사용하여 각 주어진 크기(또는 중합 정도)의 글루코시드 사슬의 상대적 수를 설명하는 사슬 길이 분포를 분석했습니다. 본 논문은 이전의 최적화 연구²¹을 기반으로 간 조직에서 글리코겐을 추출하는 방법론을 설명한다. 데이터는 글리코겐 구조를 보존하는 데 가장 적합한 방법이 10분 끓는 단계로 30%의 자당 농도임을 시사합니다.