L’extraction des molécules de glycogène hépatique pour la détermination de la structure du glycogène

Le glycogène est un polymère complexe et hyperramifié de glucose présent chez les animaux, les champignons et les bactéries¹. Chez les mammifères, le glycogène hépatique fonctionne comme un tampon de glucose sanguin, préservant l’homéostasie, tandis que le glycogène musculaire agit comme un réservoir de glucose à court terme pour fournir directement de l’énergie². La structure du glycogène est souvent décrite par trois niveaux (illustrés à la figure 1) : 1. Les chaînes linéaires sont formées par des monomères de glucose via des liaisons glycosidiques (1→4)-α, les points de ramification étant connectés via des liaisons glycosidiques (1→6)-α ; 2. particules de β hautement ramifiées (~20 nm de diamètre) qui, en particulier dans les tissus tels que le muscle squelettique, agissent comme des molécules de glycogène indépendantes ^3,4 ; 3. Particules de glycogène α plus grosses (jusqu’à 300 nm de diamètre) constituées d’unités de glycogène β plus petites, que l’on trouve dans le foie⁵, le cœur⁶ et chez certaines espèces non mammifères⁷. Les particules de α hépatique des souris diabétiques sont moléculairement fragiles, avec une propension à se dégrader en β-particules lorsqu’elles sont dissoutes dans le diméthylsulfoxyde (DMSO), tandis que les particules de α des témoins non diabétiques restent généralement inchangées. L’une des hypothèses est que cette fragilité peut exacerber le mauvais équilibre glycémique observé dans le diabète, les particules de α fragiles pouvant entraîner des proportions plus élevées de particules de β^plus rapidement dégradées 8,9,10,11.

Les méthodes traditionnelles d’extraction du glycogène utilisent les conditions relativement difficiles d’exposition du tissu hépatique à une solution alcaline chaude¹² ou à des solutions acides telles que l’acide trichloracétique (TCA)¹³ ou l’acide perchlorique (PCA)¹⁴. Bien qu’efficaces pour séparer le glycogène des autres composants du tissu hépatique, ces méthodes dégradent inévitablement la structure du glycogène dans une certaine mesure^15,16. Bien que ces méthodes soient adaptées à la mesure quantitative de la teneur en glycogène, elles ne sont pas idéales pour les études axées sur l’obtention d’informations structurelles sur le glycogène en raison de ces dommages structurels. Depuis la mise au point de ces méthodes, une procédure d’extraction plus douce a été mise au point qui utilise un tampon Tris froid (dont il a été démontré qu’il inhibe la dégradation de la glucosidase) avec une ultracentrifugation à gradient de densité de saccharose 17,18,19. Avec un pH contrôlé à ~8, cette méthode ne soumet pas le glycogène à l’hydrolyse acide ou alcaline observée dans les procédures précédentes.

L’ultracentrifugation par gradient de densité de saccharose du tissu hépatique homogénéisé peut séparer les particules de glycogène de la majorité du matériel cellulaire. Si nécessaire, une purification supplémentaire peut être effectuée par chromatographie préparative d’exclusion de taille, ce qui permet de collecter du glycogène purifié avec des protéines associées au glycogène²⁰. Bien que cette méthode, dans des conditions plus douces, soit plus susceptible de préserver la structure du glycogène, il est difficile d’empêcher la perte d’une partie du glycogène dans le surnageant, en particulier les particules de glycogène plus petites qui sont moins denses¹⁵. Une autre cause potentielle de perte de glycogène est que les conditions plus douces permettent une certaine dégradation enzymatique, ce qui entraîne des rendements en glycogène inférieurs à ceux des méthodes d’extraction plus dures. Des recherches récentes ont fait état d’une optimisation de la méthode d’extraction du glycogène hépatique pour préserver la structure du glycogène²¹. Ici, diverses concentrations de saccharose (30 %, 50 %, 72,5 %) ont été testées pour déterminer si des concentrations plus faibles de saccharose minimisaient la perte de particules de glycogène plus petites. La raison en était que la densité plus faible permettrait à des particules plus petites et moins denses de pénétrer dans la couche de saccharose et de s’agréger dans la pastille avec le reste du glycogène.

Dans cette étude, les méthodes d’extraction avec et sans étape d’ébullition de 10 minutes ont été comparées pour tester si les enzymes de dégradation du glycogène pouvaient être dénaturées, ce qui a permis d’extraire plus de glycogène qui était également exempt de dégradation partielle. Les distributions de taille de la molécule entière et les distributions de longueur de la chaîne de glycogène ont été utilisées pour déterminer la structure du glycogène extrait, similaire à une optimisation de l’extraction de l’amidon publiée précédemment²². La chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec détection de l’indice de réfraction différentielle (DRI) a été utilisée pour obtenir les distributions granulométriques du glycogène, qui décrivent le poids moléculaire total en fonction de la taille moléculaire. L’électrophorèse glucidique assistée par fluorophore (FACE) a été utilisée pour analyser les distributions de longueur de chaîne, qui décrivent le nombre relatif de chaînes glucosides de chaque taille donnée (ou degré de polymérisation). Cet article décrit la méthodologie d’extraction du glycogène des tissus hépatiques basée sur l’étude d’optimisation précédente²¹. Les données suggèrent que la méthode la plus adaptée pour préserver la structure du glycogène est une concentration de saccharose de 30% avec un pas d’ébullition de 10 minutes.