Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Glikojen, hayvanlarda, mantarlarda ve bakterilerde bulunan karmaşık, hiperdallı bir glikoz polimeridir¹. Memelilerde, karaciğer glikojeni, homeostazı koruyan bir kan şekeri tamponu olarak işlev görürken, kas glikojeni, doğrudan enerji sağlamak için kısa süreli bir glikoz rezervuarı görevi görür². Glikojenin yapısı genellikle üç seviye ile tanımlanır (Şekil 1’de gösterilmiştir): 1. Doğrusal zincirler, (1→4)-α glikozidik bağlar yoluyla glikoz monomerleri tarafından oluşturulur ve dallanma noktaları (1→6)-α glikozidik bağlarla bağlanır; 2. Özellikle iskelet kası gibi dokularda bağımsız glikojen molekülleri olarak işlev gören çok dallı β parçacıkları (~20 nm çapında) ^3,4; 3. Karaciğerde⁵, kalpte 6 ve bazı memeli olmayan türlerde bulunan daha küçük β glikojen birimlerinden oluşan daha büyük α glikojen parçacıkları (çapı³⁰⁰ nm’ye kadar)⁷. Diyabetik farelerden elde edilen hepatik α partikülleri moleküler olarak kırılgandır, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündüğünde β partiküllere bozunma eğilimi gösterirken, diyabetik olmayan kontrollerden α partiküller genellikle değişmeden kalır. Bir hipotez, bu kırılganlığın diyabette görülen zayıf kan şekeri dengesini daha da kötüleştirebileceğidir, kırılgan α partikülleri potansiyel olarak daha hızlı bozunan β partikülünün daha yüksek oranlarına neden olur 8,9,10,11.

Geleneksel glikojen ekstraksiyon yöntemleri, karaciğer dokusunu sıcak alkali çözeltiye (TCA)¹² veya trikloroasetik asit (TCA) ¹³ veya perklorik asit (PCA) ¹⁴ gibi asit çözeltilerine maruz bırakmanın nispeten sert koşullarını kullanır. Glikojeni karaciğer dokusunun diğer bileşenlerinden ayırmada etkili olmakla birlikte, bu yöntemler kaçınılmaz olarak glikojen yapısını bir dereceye kadar bozar^15,16. Bu yöntemler, glikojen içeriğinin kantitatif ölçümü için uygun olsa da, bu yapısal hasar nedeniyle glikojen hakkında yapısal bilgi elde etmeye odaklanan çalışmalar için ideal değildir. Bu yöntemlerin geliştirilmesinden bu yana, sükroz yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme ^17,18,19 ile soğuk Tris tamponu (glukozidaz bozunmasını inhibe ettiği gösterilmiştir) kullanan daha hafif bir ekstraksiyon prosedürü geliştirilmiştir. PH ~8’de kontrol edildiğinde, bu yöntem glikojeni önceki prosedürlerde görülen asit veya alkali hidrolize maruz bırakmaz.

Homojenize karaciğer dokusunun sükroz yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjü, glikojen partiküllerini hücre materyalinin çoğundan ayırabilir. Gerekirse, hazırlayıcı boyut dışlama kromatografisi ile ek saflaştırma gerçekleştirilebilir, bu da saflaştırılmış glikojenin bağlı glikojen ile ilişkili proteinlerle^{toplanmasıyla sonuçlanır 20}. Daha hafif koşullara sahip bu yöntemin glikojenin yapısını koruma olasılığı daha yüksek olsa da, glikojenin bir kısmının süpernatantta, özellikle daha az yoğun olan daha küçük glikojen parçacıklarında kaybolmasını önlemek zordur¹⁵. Glikojen kaybının bir başka potansiyel nedeni, daha ılıman koşulların bir miktar enzimatik bozunmaya izin vermesi ve bunun sonucunda daha sert ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla daha düşük glikojen verimine neden olmasıdır. Son araştırmalar, glikojen^21’in yapısını korumak için karaciğer-glikojen ekstraksiyon yönteminin optimizasyonunu bildirmiştir. Burada, daha düşük sakaroz konsantrasyonlarının daha küçük glikojen partiküllerinin kaybını en aza indirip indirmediğini belirlemek için çeşitli sükroz konsantrasyonları (%30, %50, %72.5) test edildi. Gerekçe, daha düşük yoğunluğun daha küçük, daha az yoğun parçacıkların sakaroz tabakasına nüfuz etmesine ve glikojenin geri kalanıyla birlikte pelette toplanmasına izin vermesiydi.

Bu çalışmada, glikojen bozunma enzimlerinin denatüre olup edilemeyeceğini test etmek için 10 dakikalık kaynatma aşaması olan ve olmayan ekstraksiyon yöntemleri karşılaştırıldı ve bu da kısmi bozunmadan arınmış daha fazla glikojenin ekstraksiyonu ile sonuçlandı. Daha önce yayınlanan bir nişasta ekstraksiyon optimizasyonuna benzer şekilde, ekstrakte edilen glikojenin yapısını belirlemek için tüm moleküler boyut dağılımları ve glikojen zincir uzunluğu dağılımları kullanıldı²². Diferansiyel kırılma indisi (DRI) algılamalı boyut dışlama kromatografisi (SEC), toplam moleküler ağırlığı moleküler boyutun bir fonksiyonu olarak tanımlayan glikojenin boyut dağılımlarını elde etmek için kullanıldı. Florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE), verilen her bir boyuttaki (veya polimerizasyon derecesinin) nispi glukozit zincirlerinin nispi sayısını tanımlayan zincir uzunluğu dağılımlarını analiz etmek için kullanıldı. Bu makale, önceki optimizasyon çalışmasına dayalı olarak karaciğer dokularından glikojen ekstraksiyon metodolojisini açıklamaktadır²¹. Veriler, glikojen yapısını korumak için en uygun yöntemin, 10 dakikalık bir kaynatma adımı ile% 30’luk bir sükroz konsantrasyonu olduğunu göstermektedir.