概要

L'estrazione di molecole di glicogeno epatico per la determinazione della struttura del glicogeno

Published: February 08, 2022
doi:

概要

È stata determinata una concentrazione ottimale di saccarosio per l’estrazione del glicogeno epatico utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio. L’aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti per inibire gli enzimi che degradano il glicogeno si è rivelata utile.

Abstract

Il glicogeno epatico è un polimero di glucosio iperramificato coinvolto nel mantenimento dei livelli di zucchero nel sangue negli animali. Le proprietà del glicogeno sono influenzate dalla sua struttura. Quindi, un metodo di estrazione adatto che isoli campioni rappresentativi di glicogeno è fondamentale per lo studio di questa macromolecola. Rispetto ad altri metodi di estrazione, un metodo che impiega una fase di centrifugazione a gradiente di densità del saccarosio può ridurre al minimo il danno molecolare. Sulla base di questo metodo, una recente pubblicazione descrive come la densità della soluzione di saccarosio utilizzata durante la centrifugazione sia stata variata (30%, 50%, 72,5%) per trovare la concentrazione più adatta per estrarre particelle di glicogeno di un’ampia varietà di dimensioni, limitando la perdita di particelle più piccole. È stata introdotta una fase di ebollizione di 10 minuti per testare la sua capacità di denaturare gli enzimi che degradano il glicogeno, preservando così il glicogeno. La più bassa concentrazione di saccarosio (30%) e l’aggiunta della fase di ebollizione hanno dimostrato di estrarre i campioni più rappresentativi di glicogeno.

Introduction

Il glicogeno è un polimero complesso e iperramificato del glucosio che si trova negli animali, nei funghi e nei batteri1. Nei mammiferi, il glicogeno epatico funziona come un tampone glicemico, preservando l’omeostasi, mentre il glicogeno muscolare agisce come un serbatoio di glucosio a breve termine per fornire energia direttamente2. La struttura del glicogeno è spesso descritta da tre livelli (mostrati nella Figura 1): 1. Le catene lineari sono formate da monomeri di glucosio tramite legami glicosidici (1→4)-α, con punti di diramazione collegati tramite legami glicosidici (1→6)-α; 2. particelle β altamente ramificate (~20 nm di diametro) che, soprattutto in tessuti come il muscolo scheletrico, agiscono come molecole indipendenti di glicogeno 3,4; 3. particelle di glicogeno α più grandi (fino a 300 nm di diametro) costituite da unità di glicogeno β più piccole, che si trovano nel fegato5, nel cuore6 e in alcune specie non mammiferi7. Le particelle di α epatica dei topi diabetici sono molecolarmente fragili, con una propensione a degradarsi in particelle β quando vengono disciolte in dimetilsolfossido (DMSO), mentre α particelle dei controlli non diabetici rimangono generalmente invariate. Un’ipotesi è che questa fragilità possa esacerbare lo scarso equilibrio glicemico osservato nel diabete, con le fragili particelle α che potrebbero comportare percentuali più elevate della particellaβ 8,9,10,11 degradata più rapidamente.

I metodi tradizionali di estrazione del glicogeno utilizzano le condizioni relativamente difficili di esposizione del tessuto epatico a una soluzione alcalina calda12 o a soluzioni acide come l’acido tricloroacetico (TCA)13 o l’acido perclorico (PCA)14. Sebbene siano efficaci nel separare il glicogeno da altri componenti del tessuto epatico, questi metodi degradano inevitabilmente la struttura del glicogeno in una certa misura15,16. Sebbene questi metodi siano adatti per la misurazione quantitativa del contenuto di glicogeno, non sono ideali per gli studi incentrati sull’ottenimento di informazioni strutturali sul glicogeno a causa di questo danno strutturale. Dallo sviluppo di questi metodi, è stata sviluppata una procedura di estrazione più blanda che utilizza il tampone Tris a freddo (che ha dimostrato di inibire la degradazione della glucosidasi) con ultracentrifugazione a gradiente di densitàdel saccarosio 17,18,19. Con il pH controllato a ~8, questo metodo non sottopone il glicogeno all’idrolisi acida o alcalina osservata nelle procedure precedenti.

L’ultracentrifugazione a gradiente di densità del saccarosio del tessuto epatico omogeneizzato può separare le particelle di glicogeno dalla maggior parte del materiale cellulare. Se necessario, un’ulteriore purificazione può essere eseguita mediante cromatografia preparativa ad esclusione dimensionale, con conseguente raccolta di glicogeno purificato con proteine associate al glicogeno20. Sebbene questo metodo, in condizioni più miti, abbia maggiori probabilità di preservare la struttura del glicogeno, è difficile evitare che una parte del glicogeno venga persa nel surnatante, in particolare le particelle di glicogeno più piccole che sono meno dense15. Un’altra potenziale causa di perdita di glicogeno è che le condizioni più miti consentono una certa degradazione enzimatica, con conseguente minore resa di glicogeno rispetto ai metodi di estrazione più difficili. Recenti ricerche hanno riportato l’ottimizzazione del metodo di estrazione del glicogeno epatico per preservare la struttura del glicogeno21. Qui, sono state testate varie concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%) per determinare se concentrazioni di saccarosio più basse riducessero al minimo la perdita di particelle di glicogeno più piccole. La logica era che la densità inferiore avrebbe permesso alle particelle più piccole e meno dense di penetrare nello strato di saccarosio e aggregarsi nel pellet con il resto del glicogeno.

In questo studio, i metodi di estrazione con e senza una fase di ebollizione di 10 minuti sono stati confrontati per verificare se gli enzimi di degradazione del glicogeno potessero essere denaturati, con conseguente estrazione di più glicogeno che era anche esente da degradazione parziale. Per determinare la struttura del glicogeno estratto sono state utilizzate le distribuzioni delle dimensioni molecolari intere e le distribuzioni della lunghezza della catena di glicogeno, in modo simile a un’ottimizzazione dell’estrazione dell’amido pubblicata in precedenza22. La cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) con rilevazione dell’indice di rifrazione differenziale (DRI) è stata utilizzata per ottenere le distribuzioni dimensionali del glicogeno, che descrivono il peso molecolare totale in funzione delle dimensioni molecolari. L’elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE) è stata utilizzata per analizzare le distribuzioni della lunghezza della catena, che descrivono il numero relativo di catene glucosidiche di ciascuna dimensione (o grado di polimerizzazione). Questo documento descrive la metodologia di estrazione del glicogeno dai tessuti epatici sulla base del precedente studio di ottimizzazione21. I dati suggeriscono che il metodo più adatto per preservare la struttura del glicogeno è una concentrazione di saccarosio del 30% con una fase di ebollizione di 10 minuti.

Protocol

Fegati di topo utilizzati per ottimizzare questa procedura,21 provenivano da 12 topi maschi BKS-DB/Nju (7,2 settimane di età, vedere la tabella dei materiali). L’uso degli animali è stato approvato dal Comitato Etico e per la Cura degli Animali dell’Università di Wuhan, IACUC Issue No. WDRM 20181113. 1 Tessuti animali Pesare il fegato di topo (1-1,8 g di fegato intero di ciascun topo). Congelare rapidamente il fegato di topo in az…

Representative Results

Mentre la procedura sopra descritta è per il metodo più ottimale (30% di saccarosio con l’aggiunta di una fase di ebollizione di 10 minuti), i dati sono qui forniti per il glicogeno estratto tramite tre concentrazioni di saccarosio (30%, 50%, 72,5%), con e senza una fase di ebollizione, come descritto in precedenza21. Seguendo il protocollo, la purezza, la resa grezza e la resa di glicogeno del glicogeno secco estratto in condizioni diverse sono riportate nella Tabella 1, riprod…

Discussion

Studi precedenti hanno dimostrato che la struttura del glicogeno è importante per le sue proprietà; Ad esempio, la dimensione molecolare influisce sulla velocità di degradazione del glicogeno10 e la distribuzione della lunghezza della catena influisce sulla sua solubilità26. Per comprendere correttamente queste relazioni, è importante estrarre il glicogeno con una procedura che isoli, per quanto possibile, un campione rappresentativo e non danneggiato. I metodi tradizi…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono grati al signor Gaosheng Wu e alla signorina Yunwen Zhu per l’assistenza tecnica con FACE e al signor Zhenxia Hu e al signor Dengbin per l’assistenza tecnica con SEC. MAS è supportato da una borsa di studio per la ricerca industriale Advance Queensland, dalla Mater Foundation, da Equity Trustees e dai trust LG McCallam Est e George Weaber. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma accademico prioritario degli istituti di istruzione superiore del Jiangsu, da una sovvenzione della Natural Science Foundation of China C1304013151101138 e dal programma di talenti per l’innovazione e l’imprenditorialità del Jiangsu del 2017. Le figure 1-5 sono state create utilizzando BioRender.

Materials

8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate (APTS) SIGMA Aldrich 9341 0.1 M solution
Acetic acid SIGMA Aldrich 695092 0.1 M, pH 3.5 solution
Agilent 1260 Infinity SEC system Agilent, Santa Clara, CA, USA Size-exclusion chromatography (SEC)
BKS-DB/Nju background mice Nanjing Biomedical Research Institution of Nanjing University
D-Glucose Assay Kit (GOPOD Format) Megazyme K-GLUC
Ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) SIGMA Aldrich 431788
Homogenizer IKA T 25
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
Hydrochloric acid SIGMA Aldrich 2104 0.1 M solution
P/ACE MDQ plus system Ab Sciex, US Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE)
Refractive index detector Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, USA) Size-exclusion chromatography (SEC)
Sodium acetate SIGMA Aldrich 241245 1 M, pH 4.5 solution
Sodium azide SIGMA Aldrich S2002
Sodium chloride SIGMA Aldrich S9888
Sodium cyanoborohydride SIGMA Aldrich 156159 1 M solution
Sodium fluoride SIGMA Aldrich 201154
Sodium hydroxide SIGMA Aldrich 43617 0.1 M solution
Sodium nitrate SIGMA Aldrich NISTRM8569
Sodium pyrophosphate SIGMA Aldrich 221368
Sucrose SIGMA Aldrich V90016
SUPREMA pre-column, 1,000 and 10,000 columns Polymer Standards Services, Mainz, Germany Size-exclusion chromatography (SEC)
Trizma SIGMA Aldrich T 1503
Ultracentrifuge tubes Beckman 4 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 11 x 60 mm

参考文献

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記事を引用
Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination. J. Vis. Exp. (180), e63088, doi:10.3791/63088 (2022).

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