A extração de moléculas de glicogênio hepático para determinação da estrutura do glicogênio

O glicogênio é um polímero complexo e hiperramificado de glicose encontrado em animais, fungos e bactérias¹. Em mamíferos, o glicogênio hepático funciona como um tampão glicêmico, preservando a homeostase, enquanto o glicogênio muscular atua como um reservatório de glicose de curto prazo para fornecer energia diretamente². A estrutura do glicogênio é frequentemente descrita por três níveis (mostrados na Figura 1): 1. As cadeias lineares são formadas por monômeros de glicose via ligações glicosídicas (1→4)-α, com pontos de ramificação conectados via ligações glicosídicas (1→6)-α; 2. partículas de β altamente ramificadas (~20 nm de diâmetro) que, especialmente em tecidos como o músculo esquelético, atuam como moléculas independentes de glicogênio ^3,4; 3. partículas de glicogênio α maiores (até 300 nm de diâmetro) que consistem em unidades menores de β glicogênio, que são encontradas no fígado⁵, coração⁶ e em algumas espécies não mamíferos⁷. As partículas de α hepáticas de camundongos diabéticos são molecularmente frágeis, com propensão a degradar-se em partículas de β quando dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), enquanto as partículas de α de controles não-diabéticos geralmente permanecem inalteradas. Uma hipótese é que essa fragilidade possa exacerbar o pobre balanço glicêmico observado no diabetes, sendo que as partículas frágeis de α potencialmente resultam em maiores proporções da partícula β mais rapidamente degradada 8,9,10,11.

Os métodos tradicionais de extração de glicogênio utilizam as condições relativamente adversas de exposição do tecido hepático a solução alcalina^quente12 ou soluções ácidas como o ácido tricloroacético (TCA)¹³ ou o ácido perclórico (PCA)¹⁴. Embora eficazes em separar o glicogênio de outros componentes do tecido hepático, esses métodos inevitavelmente degradam a estrutura do glicogênio até certo^ponto15,16. Embora esses métodos sejam adequados para a mensuração quantitativa do conteúdo de glicogênio, eles não são ideais para estudos focados na obtenção de informações estruturais sobre o glicogênio devido a esse dano estrutural. Desde o desenvolvimento desses métodos, um procedimento de extração mais suave tem sido desenvolvido que utiliza tampão Tris frio (que inibe a degradação de glucosidase) com ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose 17,18,19. Com o pH controlado em ~8, este método não submete o glicogênio à hidrólise ácida ou alcalina observada em procedimentos anteriores.

A ultracentrifugação do gradiente de densidade de sacarose do tecido hepático homogeneizado pode separar as partículas de glicogênio da maioria do material celular. Se necessário, purificação adicional pode ser realizada por cromatografia de exclusão de tamanho preparativo, resultando na coleta de glicogênio purificado com proteínas associadas ao glicogênio anexadas²⁰. Embora esse método, com condições mais brandas, tenha maior probabilidade de preservar a estrutura do glicogênio, é difícil evitar que alguma porção do glicogênio seja perdida no sobrenadante, especialmente partículas menores de glicogênio e menos densas¹⁵. Outra causa potencial de perda de glicogênio é que as condições mais brandas permitem alguma degradação enzimática, resultando em rendimentos de glicogênio mais baixos em comparação com métodos de extração mais severos. Pesquisas recentes relataram otimização do método de extração de glicogênio hepático para preservar a estrutura do glicogênio²¹. Aqui, várias concentrações de sacarose (30%, 50%, 72,5%) foram testadas para determinar se concentrações mais baixas de sacarose minimizavam a perda de partículas menores de glicogênio. A justificativa era que a menor densidade permitiria que partículas menores e menos densas penetrassem na camada de sacarose e se agregassem no pellet com o restante do glicogênio.

Neste estudo, os métodos de extração com e sem uma etapa de ebulição de 10 min foram comparados para testar se as enzimas de degradação de glicogênio poderiam ser desnaturadas, resultando na extração de mais glicogênio que também estava livre de degradação parcial. Distribuições de tamanho molecular total e de comprimento da cadeia glicogênica foram usadas para determinar a estrutura do glicogênio extraído, semelhante a uma otimização de extração de amido publicada anteriormente²². Cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com detecção de índice de refração diferencial (DRI) foi utilizada para obter as distribuições de tamanho do glicogênio, que descrevem o peso molecular total em função do tamanho molecular. A eletroforese de carboidratos assistida por fluoróforos (FACE) foi utilizada para analisar as distribuições de comprimento de cadeia, que descrevem o número relativo de cadeias glicosídicas de cada tamanho (ou grau de polimerização). Este trabalho descreve a metodologia de extração de glicogênio de tecidos hepáticos baseada em estudo prévio de^{otimização21}. Os dados sugerem que o método mais adequado para preservar a estrutura do glicogênio é uma concentração de sacarose de 30% com uma etapa de ebulição de 10 min.