Die Extraktion von Leberglykogenmolekülen zur Glykogenstrukturbestimmung

Glykogen ist ein komplexes, hyperverzweigtes Glukosepolymer, das in Tieren, Pilzen und Bakterien vorkommt¹. Bei Säugetieren fungiert das Glykogen der Leber als Blutzuckerpuffer und erhält die Homöostase, während das Muskelglykogen als kurzfristiges Glukosereservoir fungiert, um Energie direkt bereitzustellen². Die Struktur von Glykogen wird häufig durch drei Ebenen beschrieben (siehe Abbildung 1): 1. Lineare Ketten werden von Glukosemonomeren über (1→4)-α glykosidische Bindungen gebildet, wobei Verzweigungspunkte über (1→6)-α glykosidische Bindungen verbunden sind; 2. stark verzweigte β Partikel (~20 nm Durchmesser), die, insbesondere in Geweben wie der Skelettmuskulatur, als unabhängige Glykogenmoleküle wirken ^3,4; 3. Größere α Glykogenpartikel (bis zu 300 nm Durchmesser), die aus kleineren β Glykogeneinheiten bestehen, die in der Leber⁵, im Herzen⁶ und in einigen Nicht-Säugetierarten⁷ vorkommen. Leber-α-Partikel von diabetischen Mäusen sind molekular zerbrechlich und neigen dazu, zu β-Partikeln abgebaut zu werden, wenn sie in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst werden, während α Partikel von nicht-diabetischen Kontrollen im Allgemeinen unverändert bleiben. Eine Hypothese ist, dass diese Fragilität den schlechten Blutzuckerhaushalt bei Diabetes verschlimmern kann, wobei die empfindlichen α Partikel möglicherweise zu höheren Anteilen der schneller abbaubaren β Partikel 8,9,10,11 führen.

Herkömmliche Glykogenextraktionsmethoden nutzen die relativ rauen Bedingungen, bei denen das Lebergewebe heißer alkalischer Lösung¹² oder sauren Lösungen wie Trichloressigsäure (TCA)¹³ oder Perchlorsäure (PCA)¹⁴ ausgesetzt wird. Diese Methoden sind zwar wirksam bei der Trennung des Glykogens von anderen Bestandteilen des Lebergewebes, bauen aber unweigerlich die Glykogenstruktur bis zu einem gewissen Grad ab^15,16. Obwohl diese Methoden für die quantitative Messung des Glykogengehalts geeignet sind, sind sie aufgrund dieser strukturellen Schädigung nicht ideal für Studien, die sich auf die Gewinnung struktureller Informationen über das Glykogen konzentrieren. Seit der Entwicklung dieser Methoden wurde ein milderes Extraktionsverfahren entwickelt, bei dem kalter Tris-Puffer (der nachweislich den Glucosidaseabbau hemmt) mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet^wird 17,18,19. Da der pH-Wert auf ~8 eingestellt ist, wird das Glykogen bei dieser Methode nicht der sauren oder alkalischen Hydrolyse ausgesetzt, die bei früheren Verfahren beobachtet wurde.

Die Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation von homogenisiertem Lebergewebe kann Glykogenpartikel vom Großteil des Zellmaterials trennen. Falls erforderlich, kann eine zusätzliche Reinigung durch präparative Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden, was zur Sammlung von gereinigtem Glykogen mit angehängten Glykogen-assoziierten Proteinen^{führt 20}. Obwohl diese Methode unter milderen Bedingungen die Struktur des Glykogens eher bewahrt, ist es schwierig zu verhindern, dass ein Teil des Glykogens im Überstand verloren geht, insbesondere bei kleineren Glykogenpartikeln, die weniger dicht sind¹⁵. Eine weitere mögliche Ursache für den Glykogenverlust ist, dass die milderen Bedingungen einen gewissen enzymatischen Abbau ermöglichen, was im Vergleich zu härteren Extraktionsmethoden zu niedrigeren Glykogenausbeuten führt. Neuere Forschungen berichteten über die Optimierung der Leber-Glykogen-Extraktionsmethode, um die Struktur von Glykogen²¹ zu erhalten. Hier wurden verschiedene Saccharosekonzentrationen (30 %, 50 %, 72,5 %) getestet, um festzustellen, ob niedrigere Saccharosekonzentrationen den Verlust kleinerer Glykogenpartikel minimieren. Der Grundgedanke war, dass die geringere Dichte es kleineren, weniger dichten Partikeln ermöglichen würde, die Saccharoseschicht zu durchdringen und sich mit dem Rest des Glykogens im Pellet zu aggregieren.

In dieser Studie wurden die Extraktionsmethoden mit und ohne einen 10-minütigen Siedeschritt verglichen, um zu testen, ob Glykogenabbauenzyme denaturiert werden können, was zur Extraktion von mehr Glykogen führt, das auch frei von teilweisem Abbau ist. Zur Bestimmung der Struktur des extrahierten Glykogens wurden ganze Molekülgrößenverteilungen und die Längenverteilungen der Glykogenkette verwendet, ähnlich einer zuvor veröffentlichten Optimierung der Stärkeextraktion²². Die Größenausschlusschromatographie (SEC) mit differentiellem Brechungsindex (DRI) wurde verwendet, um die Größenverteilungen von Glykogen zu erhalten, die das Gesamtmolekulargewicht als Funktion der Molekülgröße beschreiben. Die Fluorophor-gestützte Kohlenhydratelektrophorese (FACE) wurde verwendet, um die Kettenlängenverteilungen zu analysieren, die die relative Anzahl der Glucosidketten jeder bestimmten Größe (oder jedes Polymerisationsgrades) beschreiben. In diesem Artikel wird die Methodik zur Extraktion von Glykogen aus Lebergewebe beschrieben, die auf der vorherigen Optimierungsstudie²¹ basiert. Die Daten deuten darauf hin, dass die Methode, die am besten geeignet ist, um die Glykogenstruktur zu erhalten, eine Saccharosekonzentration von 30 % mit einem 10-minütigen Siedeschritt ist.