מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

גליקוגן הוא פולימר מורכב והיפר-מסועף של גלוקוז המצוי בבעלי חיים, פטריות וחיידקים¹. ביונקים, הגליקוגן בכבד מתפקד כחוצץ גלוקוז בדם, המשמר את ההומאוסטזיס, בעוד הגליקוגן בשריר פועל כמאגר גלוקוז לטווח קצר כדי לספק אנרגיה ישירות². מבנה הגליקוגן מתואר לעתים קרובות על-ידי שלוש רמות (מוצגות באיור 1): 1. שרשראות ליניאריות נוצרות על-ידי מונומרים של גלוקוז באמצעות (1→4)-α קשרים גליקוזידיים, כאשר נקודות ההסתעפות מחוברות באמצעות (1→6)-α קשרים גליקוזידיים; 2. חלקיקי β מסועפים מאוד (~ 20 ננומטר קוטר) אשר, במיוחד ברקמות כגון שרירי השלד, פועלים כמולקולות גליקוגן עצמאיות ^3,4; 3. חלקיקי גליקוגן α גדולים יותר (בקוטר של עד 300 ננומטר) המורכבים מיחידות גליקוגן β קטנות יותר, המצויות בכבד⁵, בלב⁶ ובכמה מינים שאינם יונקים⁷. חלקיקי α בכבד מעכברים סוכרתיים הם שבירים מולקולרית, עם נטייה להתפרק לחלקיקי β כאשר הם מומסים בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), בעוד α חלקיקים מבקרות שאינן סוכרתיות נשארים בדרך כלל ללא שינוי. השערה אחת היא כי שבריריות זו עלולה להחמיר את מאזן הגלוקוז הלקוי בדם שנראה בסוכרת, כאשר חלקיקי α השבריריים עלולים לגרום לשיעורים גבוהים יותר^{של חלקיקי} β 8,9,10,11 המתפרקים במהירות רבה יותר.

שיטות מיצוי גליקוגן מסורתיות מנצלות את התנאים הקשים יחסית של חשיפת רקמת הכבד לתמיסת אלקליין חמה¹² או לתמיסות חומצה כגון חומצה טריכלורואצטית (TCA)¹³ או חומצה פרכלורית (PCA)¹⁴. בעוד שהן יעילות בהפרדת הגליקוגן ממרכיבים אחרים של רקמת הכבד, שיטות אלה בהכרח פוגעות במבנה הגליקוגן במידה מסוימת^15,16. למרות ששיטות אלה מתאימות למדידה כמותית של תכולת הגליקוגן, הן אינן אידיאליות למחקרים המתמקדים בקבלת מידע מבני על הגליקוגן עקב נזק מבני זה. מאז פיתוח שיטות אלה, פותח הליך מיצוי מתון יותר המשתמש בחיץ טריס קר (הוכח כמעכב פירוק גלוקוזידאז) עם אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז 17,18,19. כאשר ה- pH נשלט ב~8, שיטה זו אינה מכפיפה את הגליקוגן להידרוליזה חומצית או בסיסית שנצפתה בהליכים קודמים.

צפיפות סוכרוז אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של רקמת כבד הומוגנית יכולה להפריד חלקיקי גליקוגן מרוב חומר התא. במידת הצורך, ניתן לבצע טיהור נוסף על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל הכנה, וכתוצאה מכך איסוף של גליקוגן מטוהר עם חלבונים הקשורים לגליקוגן מחוברים²⁰. למרות ששיטה זו, בתנאים מתונים יותר, נוטה יותר לשמר את מבנה הגליקוגן, קשה למנוע אובדן חלק מהגליקוגן בסופרנטנט, במיוחד חלקיקי גליקוגן קטנים יותר שהם פחות צפופים¹⁵. גורם אפשרי נוסף לאובדן הגליקוגן הוא שהתנאים המתונים יותר מאפשרים פירוק אנזימטי מסוים, וכתוצאה מכך תפוקת הגליקוגן נמוכה יותר בהשוואה לשיטות מיצוי קשות יותר. מחקר שנערך לאחרונה דיווח על אופטימיזציה של שיטת מיצוי הגליקוגן בכבד כדי לשמר את המבנה של גליקוגן²¹. כאן נבדקו ריכוזי סוכרוז שונים (30%, 50%, 72.5%) כדי לקבוע אם ריכוזי סוכרוז נמוכים יותר מזערו את אובדן חלקיקי הגליקוגן הקטנים יותר. הרציונל היה שהצפיפות הנמוכה יותר תאפשר לחלקיקים קטנים וצפופים פחות לחדור את שכבת הסוכרוז ולהצטבר בכדורית עם שאר הגליקוגן.

במחקר זה, שיטות המיצוי עם ובלי שלב הרתחה של 10 דקות הושוו כדי לבדוק אם אנזימי פירוק גליקוגן יכולים להיות דנטורציה, וכתוצאה מכך מיצוי של יותר גליקוגן שהיה גם ללא פירוק חלקי. התפלגות גודל מולקולרית שלמה והתפלגויות אורך שרשרת הגליקוגן שימשו לקביעת מבנה הגליקוגן המופק, בדומה לאופטימיזציה של מיצוי עמילן שפורסמה קודם לכן²². כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC) עם זיהוי אינדקס שבירה דיפרנציאלי (DRI) שימשה להשגת התפלגות הגודל של הגליקוגן, המתארות את המשקל המולקולרי הכולל כפונקציה של גודל מולקולרי. אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE) שימשה לניתוח התפלגות אורך השרשרת, המתארות את המספר היחסי של שרשראות גלוקוזיד בכל גודל נתון (או מידת פילמור). מאמר זה מתאר את המתודולוגיה של חילוץ גליקוגן מרקמות הכבד בהתבסס על מחקר האופטימיזציה הקודם²¹. הנתונים מצביעים על כך שהשיטה המתאימה ביותר לשימור מבנה הגליקוגן היא ריכוז סוכרוז של 30% עם שלב רתיחה של 10 דקות.