استخراج جزيئات الجليكوجين في الكبد لتحديد بنية الجليكوجين

الجليكوجين هو بوليمر معقد مفرط التفرع من الجلوكوز الموجود في والفطريات والبكتيريا¹. في الثدييات ، يعمل الجليكوجين في الكبد كمخزن مؤقت للجلوكوز في الدم ، ويحافظ على التوازن ، بينما يعمل الجليكوجين العضلي كخزان للجلوكوز على المدى القصير لتوفير الطاقة مباشرة². غالبا ما يتم وصف بنية الجليكوجين بثلاثة مستويات (كما هو موضح في الشكل 1): 1. تتشكل السلاسل الخطية بواسطة مونومرات الجلوكوز عبر روابط جليكوسيدية (1→4) -α ، مع توصيل نقاط فرعية عبر (1→6) -α روابط جليكوسيدية. 2. جزيئات β متفرعة للغاية (~ 20 نانومتر في القطر) والتي ، خاصة في الأنسجة مثل العضلات الهيكلية ، تعمل كجزيئات جليكوجين مستقلة ^3,4 ؛ 3. جزيئات الجليكوجين α الأكبر (يصل قطرها إلى 300 نانومتر) والتي تتكون من وحدات الجليكوجين β الأصغر ، والتي توجد في الكبد⁵ ، القلب⁶ ، وفي بعض الأنواع غير الثديية⁷. جزيئات α الكبدية من الفئران المصابة بالسكري هشة جزيئيا ، مع ميل إلى التحلل إلى جزيئات β عند إذابتها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، في حين أن الجسيمات α من الضوابط غير السكرية تظل دون تغيير بشكل عام. إحدى الفرضيات هي أن هذه الهشاشة قد تؤدي إلى تفاقم ضعف توازن الجلوكوز في الدم الذي يظهر في مرض السكري ، حيث من المحتمل أن تؤدي جزيئات α الهشة إلى نسب أعلى من الجسيمات β المتدهورة بسرعة^8،9،10،11.

تستخدم طرق استخراج الجليكوجين التقليدية الظروف القاسية نسبيا لتعريض أنسجة الكبد لمحلول قلوي ساخن¹² أو محاليل حمضية مثل حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA) ¹³ أو حمض البيركلوريك (PCA) ¹⁴. في حين أن هذه الطرق فعالة في فصل الجليكوجين عن المكونات الأخرى لأنسجة الكبد ، إلا أن هذه الطرق تؤدي حتما إلى تدهور بنية الجليكوجين إلى حد ما^15,16. على الرغم من أن هذه الطرق مناسبة للقياس الكمي لمحتوى الجليكوجين ، إلا أنها ليست مثالية للدراسات التي تركز على الحصول على معلومات هيكلية عن الجليكوجين بسبب هذا الضرر الهيكلي. منذ تطوير هذه الطرق ، تم تطوير إجراء استخراج أكثر اعتدالا يستخدم المخزن المؤقت البارد Tris (يظهر أنه يمنع تدهور الجلوكوزيداز) مع الطرد المركزي الفائق لتدرج كثافة السكروز^17،18،19. مع التحكم في درجة الحموضة عند ~ 8 ، لا تخضع هذه الطريقة الجليكوجين للتحلل المائي الحمضي أو القلوي الذي شوهد في الإجراءات السابقة.

يمكن للطرد المركزي الفائق المتدرج لكثافة السكروز لأنسجة الكبد المتجانسة فصل جزيئات الجليكوجين عن غالبية مواد الخلية. إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء تنقية إضافية عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم التحضيري ، مما يؤدي إلى جمع الجليكوجين المنقى مع البروتينات المرتبطة بالجليكوجين^{المرفقة 20}. على الرغم من أن هذه الطريقة ، مع ظروف أكثر اعتدالا ، من المرجح أن تحافظ على بنية الجليكوجين ، إلا أنه من الصعب منع فقدان جزء من الجليكوجين في المادة الطافية ، وخاصة جزيئات الجليكوجين الأصغر التي تكون أقل كثافة¹⁵. سبب آخر محتمل لفقدان الجليكوجين هو أن الظروف الأكثر اعتدالا تسمح ببعض التدهور الأنزيمي ، مما يؤدي إلى انخفاض غلة الجليكوجين مقارنة بطرق الاستخراج الأكثر قسوة. أفادت الأبحاث الحديثة عن تحسين طريقة استخراج الكبد والجليكوجين للحفاظ على بنية الجليكوجين²¹. هنا ، تم اختبار تركيزات السكروز المختلفة (30٪ ، 50٪ ، 72.5٪) لتحديد ما إذا كانت تركيزات السكروز المنخفضة تقلل من فقدان جزيئات الجليكوجين الأصغر. كان الأساس المنطقي هو أن الكثافة المنخفضة ستسمح للجسيمات الأصغر والأقل كثافة باختراق طبقة السكروز وتجميعها في الحبيبات مع بقية الجليكوجين.

في هذه الدراسة ، تمت مقارنة طرق الاستخراج مع وبدون خطوة غليان مدتها 10 دقائق لاختبار ما إذا كان يمكن تغيير طبيعة إنزيمات تحلل الجليكوجين ، مما أدى إلى استخراج المزيد من الجليكوجين الذي كان أيضا خاليا من التحلل الجزئي. تم استخدام توزيعات الحجم الجزيئي الكامل وتوزيعات طول سلسلة الجليكوجين لتحديد بنية الجليكوجين المستخرج ، على غرار تحسين استخراج النشا المنشور سابقا²². تم استخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) مع اكتشاف معامل الانكسار التفاضلي (DRI) للحصول على توزيعات حجم الجليكوجين ، والتي تصف الوزن الجزيئي الكلي كدالة للحجم الجزيئي. تم استخدام الرحلان الكهربائي للكربوهيدرات بمساعدة الفلوروفور (FACE) لتحليل توزيعات طول السلسلة ، والتي تصف العدد النسبي لسلاسل الجلوكوزيد لكل حجم معين (أو درجة البلمرة). تصف هذه الورقة منهجية استخراج الجليكوجين من أنسجة الكبد بناء على دراسة التحسين السابقة²¹. تشير البيانات إلى أن الطريقة الأكثر ملاءمة للحفاظ على بنية الجليكوجين هي تركيز السكروز بنسبة 30٪ مع خطوة غليان مدتها 10 دقائق.