Biz yüksek içerik görüntüleme ile otomatik hücre kültür birleştirerek yüksek verimli bir şekilde, çoklu hücresel süreçleri ve yapıları görselleştirmek ve ölçmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu yöntemler daha fonksiyonel ek açıklama genomların yardım yanı sıra hastalık gen ağları ve potansiyel ilaç hedefleri belirleyebilir.
Genomların işlevsel açıklama, inşaat, moleküler ağlar ve yeni ilaç hedef tanımlama 1-4 ehemmiyetli bir mesele olarak ele alınması gereken önemli sorunlar olarak karşımıza çıkıyor. Çoklu tamamlayıcı 'omics yaklaşımları, genetik risk faktörleri ve birçok nörodejeneratif hastalıkların altında yatan patojenik mekanizmaları olarak ipuçları vermiş, ancak en bulgular hala işlevsel doğrulama 5 gerektirir . Örneğin Parkinson Hastalığı (PH) hastalığı için risk faktörü olarak tanımlanan pek çok yeni lokusların, ancak altta yatan etken varyant (ler) veya patojenik mekanizma için yeni bir genom ilişki çalışmasında, 6, 7 bilinmemektedir. Ilişkili her bölgede birçok gen içerebileceği gibi, hücre biyolojisi, geleneksel teknikleri kullanarak, hastalığı ile ilişkili fenotipleri genlerin her biri işlevsel bir değerlendirme çok uzun sürecektir.
Moleküler ağlar anlamak için de ihtiyaç vardır bu bağlantıyıneden fenotipleri genetik mutasyonlar. Bu hastalık fenotipleri bozulmuştur birden fazla etkileşimlerin sonucu olduğunu bekleniyor. Geleneksel moleküler yöntemler kullanılarak bu ağların İmar zaman alıcı olacaktır. Ayrıca, ağ bileşenleri tek tek bağımsız çalışmalar, indirgemecilik yaklaşım, tahminler, muhtemelen ağ karmaşıklığını 8 hafife . Bu, kısmen, küçümsenmesi, istenmeyen ya da toksik yan etkileri nedeniyle ilaç onayı düşük başarı oranı ile açıklanabilir. İY / HC hücresel tarama yaklaşımları kullanarak, bu yollar içinde anahtar düğümleri tanımlamak hastalığı ile ilgili yollarının bir ağ bakış açısı kazanmak, terapötik müdahale için daha uygun olan hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir.
Yüksek verim tarama (HTS), 9-12, bu sorunları gidermek için ideal bir yöntem. ancak geleneksel yöntemlerle simpli kullanılan tek boyutlu tüm iyi hücre deneyleri,STIC karmaşık biyolojik süreçler için readouts. Onlar gibi, morfoloji özellikleri, 13, 14 aksonal ulaşım açıkları veya değişiklikler gibi nörodejeneratif hastalıklarda görülen birçok fenotipleri aynı anda ölçmek için koyamadık . Bu yaklaşım, bir hücre alt grubunda meydana gelen hücresel süreçleri ya da patojenik olayları dinamik doğasını araştırmak için kullanılan olamazdı. Bir çok-boyutlu fenotipleri geçmek için bu tür özellikleri ölçmek için yüksek içerik tarama (HCS) 4, 15-17 olarak nitelendirdi. HCS HTS göre çeşitli tedirginlikler hücresel yanıt daha ayrıntılı bir gösterimini sağlar, aynı anda çeşitli süreçlerin hücre tabanlı nicelikleme.
HCS HTS 18, 19 üzerinden pek çok avantajı vardır, ancak nöronal modelleri, yüksek verimli (HT) yüksek içerik (HC) ekran yapmak, yüksek maliyet, çevresel değişim ve insan hatası nedeniyle sorunludur. 'Phenomics ölçekte hücresel tepkileri tespit etmek içinHC görüntüleme birini kullanarak, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik artırırken, değişim ve hatayı azaltmak için vardır.
Bu yazıda shRNA ekranlarında nöronal hücre modellerinde otomatik Hücre kültü 20 ve HC görüntüleme kullanarak doğru ve güvenilir yapmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz biz mutasyona uğramış otozomal resesif parkinsonizm 21 neden belirli bir protein, DJ1, modülatörler tanımlamak için bu metodoloji nasıl kullanıldığını açıklar.
HC görüntüleme HT yöntemleri ile çok yönlülüğünü birleştiren doğru bir bolluk fenotipleri ölçmek için mümkündür. Bu sonradan genomu anlayışımıza, hastalığın patogenezinde yer yolların yanı sıra potansiyel terapötik hedefler belirlemek ilerlemek için yararlanılabilir.
Gen işlevini değiştirmek için güçlü bir genom araçlarının durumu ile kombine HT / HC hücresel tarama sistemleri, azalan maliyetler, HT / HC ekranlar akademide olağan hale gelmiştir. Bu yaklaşım zaten başarıyla araştırma, kanser 9, 31-33 ve embriyonik gelişim 34-36 ilaç hedeflerinin belirlenmesi gibi çeşitli alanlarda uygulanan ve hatta nöropsikiyatrik hastalıklarda 37,38 dahil yollar deşifre uygulama potansiyeline sahiptir. Ancak böyle bir sistemin uygulanması, genellikle en az 6 aylık bir süreç optimizasyonu ile zaman ve çaba önemli bir yatırım gerektirir. Trypsinization kez pipetleme hızları ve ekim yoğunlukları gibi tüm adımlar, hücrelerin sağlıklı olmasını sağlamak ve sürekli büyümeye ayarlanması gerekir. Bakteriyel kontaminasyonun önlenmesi, c haftalık temizlik protokolleri ile otomatik hücre kültürü karşılaştığı en zor durumlardan birikirlenme ücretsiz kültürler için gerekli olan% 70 etanol ile tüm sıvı taşıyan hatların sabit durulama ile ombination. Bu robotik geliştirmek için de gerekli olacak, böylece, yüksek çözünürlük ve -80 ° C derin dondurucular bileşik depolama için entegre edilebilir konfokal mikroskoplar gibi ek araçlar.
Gen ağları çalışma ve patojenik moleküler yolaklar ilgili genleri tanımlamak için bu yöntemi duyarlı, hızlı ve faydalı artırmak için ele alınması gereken sınırlamalar da vardır.
HT / HC ekran davranış ve güvenilir veri toplanmış olduğundan emin olmak için, çeşitli yönleriyle optimize edilmiş olması. İlk olarak, ölçüm güvenilirliği çok önemlidir ve sağlamlık ve duyarlılık testinin bağlı. Örneğin, yukarıda açıklanan deneyleri, küçük ekranlar için uygundur, ancak görüntü elde etme önce gerekli sayı işleme adımları nedeniyle geniş çaplı bir genom, uygulamak zor.Böylece, doğrudan görüntüleme için izin ve işlem adımları az sayıda nedeniyle azalmış varyasyon yol açacak muhabiri gen ifade istikrarlı hücre hatları inşa etmek olurdu. Şu anda, doğru bir tasvir ve güvenilir bir ilgi fenotipi HC tarama sürecinin büyük bir darboğaz olduğunu rakamlarla bir test tasarımı.
Birçok ekranlarında-hedef dışı etkileri sınırlı gen susturulması verimlilik ve eksik genom kapsama muzdarip her biri farklı RNAi kütüphaneler, memeli hücreleri kullanılarak yapılmaktadır. Böylece kütüphaneler, daha spesifik, güçlü ve daha iyi bir kapsama sahip olduğu yapılması gerekir. Oluşturmak için çalışmalar devam etmektedir bu tür bu tür çabalar İY / HC scre tekrarlanabilirliğini artıracak umulmaktadır tr vurur.
Onlar genetik göreli kolaylıkla manipüle ve çok sayıda etmek için kültürü, çünkü birçok büyük ölçekli hücre tabanlı ekranlar bir sınırlama nöroblastom hücrelerinde yapılır. Ancak, in vivo fonksiyonu, ex-vivo hücre kültürü modelleri tanımlanan 'hit' alaka beyin sinaptik bağlantıların fonksiyonu için son derece entegre bir birim olarak yoğun ve karmaşık bir ağ oluşturan son derece uzmanlaşmış hücre tipleri oluşur, özellikle de sorgulanabilir. Sonuç olarak, yukarıda açıklanan tarama yaklaşımı kullanılarak belirlenen ek teknikler kullanılarak ikincil ekranları ve daha fizyolojik ilgili modelleri 39 valide Vurduğu yaygındır. HCS sırasında tanımlanan çeviri hit artırmak için, birincil hücre ve farklılaşmış kök hücreler ya da ko-kültür sistemleri gibi daha temsili ve sofistike modelleri, İY / HC yaklaşımlar için geliştirilen ve adapte olması gerekir.
otomatik hücre kültür ve HC görüntüleme tek bir kombinasyonu ile ntent "> nöron fonksiyonu nasıl içine hızla yeni anlayışlar kazanmak ve hangi yollar hastalık gelişiminde önemli 'diğer omics' yaklaşımlar elde edilen bilgiler ile HCS / HTS verileri birleştiren belirlemek, sonra beyin hastalıkları bir sistem biyolojisi genel bakış oluşturmak için, böylece tedavi gelişimi kolaylaştırmak mümkün.The authors have nothing to disclose.
Hamilton programcılar ve uzman teknik yardım için sürekli destek ve Eva Blaas için teşekkür ederiz. T5-207: SJ Ti-Pharma tarafından desteklenen; Bu çalışma iki NWO Yatırım hibe (911-07-031 ve 40-00506-98-10011), Prinses Beatrix Viyana Wetenschapsprijs 2009 ve Nörobilim Kampüsü Amsterdam tarafından desteklenmiştir.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |