Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

1. Automatizado de células adherentes proceso de cultivo (Figura 1) 20 Prepare el sistema de cultivo de células automatizado para la entrada de las placas de cultivo celular. Consumibles de carga (por ejemplo, puntas de pipeta, placas de cultivo celular, placas de ensayo) en el sistema utilizando la interfaz gráfica de usuario (GUI). Asegúrese de que hay suficientes medios de cultivo celular, tampón fosfato salino (PBS) y tripsina en el sistema robótico. Manual de la semilla dos placas omnitray con 2 x 10 6 células por placa, de la línea de neuroblastoma SH-SY5Y células. Mantener las células en Opti-MEM con 10% de suero fetal bovino (SFB). Poner los platos en el robot de cultivo celular mediante la GUI. Las células se incubaron a 37 º C y 5% CO 2. Elegir qué protocolo de cultivo celular debe iniciarse 20. Uno puede elegir entre un proceso de cultivo de células adherentes 22, el cultivo y la expansión de células madre embrionarias (ES) las células en células alimentadoras del ratón 23 o el cultivo de la suspensión cells 22. Seleccione el protocolo de cultivo de células adherentes (Figura 1) y asegurar la adherencia archivos de la línea celular específica de parámetros se ajustan de manera que el umbral de confluencia (el área de la placa omnitray que contiene las células) se ha fijado en 70%. Establecer el tiempo total de tripsinización a dos minutos. Instruir al robot para preparar nuevos platos omnitray, con un número de células de siembra de 2 x 10 6 células por placa. Platos de entrada omnitray en el sistema de cultivo celular utilizando el protocolo automatizado de cultivo de células adherentes (Figura 1). Este protocolo incluye los siguientes pasos: las placas se incuban y la imagen hasta llegar al umbral de confluencia pre-definidos. Si las células no alcanzan el umbral de confluencia dentro de los 5 lecturas, las placas se eliminan del sistema. Al llegar a la confluencia del umbral definido por el usuario, se lavan las células, y contó con tripsina. Un determinado número de células se añaden a las placas de omnitray nuevo y si hay un número suficiente de células, una insensible especificadoer de placas de ensayo son transportados a la cubierta y un número determinado de células en cada pocillo. Las placas de ensayo puede ser fotografiado directamente con el microscopio integrado o salida del sistema para su posterior procesamiento. Indicar al sistema que preparar 4 placas de ensayo por placa omnitray, con un total de 5.000 células por pocillo. 2. ARNhc la producción de virus y de las planchas en las placas de ensayo (Tiempo: 6 días) Crecen las poblaciones bacterianas de glicerol que contiene los vectores shRNA (Open Biosystems, TRC1) durante la noche en 2 ml de los medios de comunicación medio Luria-Bertani conteniendo 100 mg / ml de ampicilina (Sigma-Aldrich). Extracto de plásmidos siguiendo el protocolo del fabricante (Promega Asistente MagneSil TFX). Producir virus con el Consorcio de RNAi de alto rendimiento de la producción lentivirales (96 pocillos) el protocolo 24. Trabajar con lentivirus es relativamente seguro, porque las partículas de virus para la transducción de la replicación son deficientes y de divisiónestrategias gen de embalaje se utilizan para su producción. Sin embargo, cuando se trabaja con lentivirus, los procedimientos de bioseguridad adicionales son necesarias para reducir al mínimo el riesgo para uno mismo y los demás 25. Todos los experimentos deben realizarse en un laboratorio de nivel MLII o BSL2 seguridad. Todos los plásticos (pipetas, platos de plástico, los medios de comunicación) que han estado en contacto con partículas de lentivirus se incuban con cloro durante 24 horas antes de su eliminación. Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de los lentivirus, determinando el porcentaje de células GFP positivos con el plásmido GFP pLKO.1 (Sigma-Aldrich). Placa de lentivirus en las placas de ensayo, con una MOI de 3. 3. Transducción de lentivirus y la diferenciación neuronal de células SH-SY5Y (Tiempo: 6 días) Las células se añaden a las placas de ensayo (véase el paso 1.7). De carga placas de ensayo que contienen lentivirus ARNhc en el sistema de cultivo de células automatizado. Después de 24 horas, los medios de comunicación en laplacas de ensayo se cambiará a Opti-MEM que contiene 0,5% de SFB y 0,1 M de ácido retinoico para iniciar el proceso de diferenciación. La diferenciación de las células SH-SY5Y permite la visualización de las estructuras neuríticas y sincroniza la división celular. Continuar la incubación de las placas de ensayo en los medios de diferenciación, durante 5 días. Esto asegura la máxima caída de la expresión del gen diana. El día 5, se añaden 50 mM H 2 O 2 a la mitad de las placas de ensayo durante 24 horas para estimular la translocación de DJ1 a la mitocondria. El día 6, añadir CmxROS Mitotracker (Invitrogen) a las células a una concentración final de 200 nM por pocillo y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. Se puede indicar al sistema que las placas de imagen directamente usando la cámara de HC o placas se pueden exportar desde el sistema para su posterior procesamiento. 4. Inmunotinción automatizado de placas de ensayo (Tiempo: 2 días) La calidad de imagen es paramount para la realización de una sensible y fiable HCS. El daño a la monocapa celular, debido a pipeteo inexacto puede conducir a mala calidad de imagen y resultados irreproducibles. Con el fin de minimizar el daño de la capa celular, la inmunotinción se realizó utilizando una estación robótica. El procedimiento es similar a uno que ha sido descrito previamente 26, pero se ha personalizado para aumentar el rendimiento y reducir el uso de consumibles. Fijar las células con 100 l de paraformaldehído al 4% de pre-calentado a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. Incubar las placas de ensayo con 200 l de PBS que contenía 0,1% de Triton (PBST) durante 10 minutos. Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. Incubar las placas de ensayo con 200 l de buffer de bloque (PBST con FBS al 5%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. Incubar con el ejerdebido anticuerpos primarios noche a 4 ° C: Cabra DJ1 N20 (Santa Cruz, 5 mg / ml) Conejo β-tubulina III (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) Al día siguiente, lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. Incubar las placas de ensayo con los siguientes anticuerpos secundarios de 1 hora a temperatura ambiente: AlexaFluor 488 burro anti-cabra (Invitrogen, 2 mg / ml) AlexaFluor 647 cabra anti-conejo (Invitrogen, 2 mg / ml Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. Las células se incuban con Hoechst (Invitrogen, 1 mg / ml) durante 10 minutos. Lavar las células con 200 l de PBS durante 5 minutos, 3 veces. Las placas se almacenan a 4 ° C hasta que se pueden obtener imágenes. 5. Imagen de alto contenido de adquisición y análisis de imágenes (Tiempo: 5 días) Imagen de un total de 30 campos por bien con la lente del objetivo de 20x. Visualizar DJ1 con la FITC conjunto de filtros, la mitocondria con el conjunto de filtros TRITC, β-tubulina III con el conjunto de filtros Cy5 y los núcleos utilizando el conjunto de filtro UV (Figura 3). Analizará las imágenes utilizando el Bioapplication análisis compartimental (Cellomics, ThermoFisher) para determinar la intensidad media de la señal de Mitotracker dentro de las mitocondrias. (Figura 4 B, F). Para determinar el coeficiente promedio de superposición entre DJ1 y las mitocondrias, analizará las imágenes utilizando el bioapplication colocalización Cellomics (Cellomics, ThermoFisher). Definir regiones de interés (ROI) de la siguiente manera: Un retorno de la inversión – el núcleo (Figura 4 A, E), retorno de la inversión B – las mitocondrias (Figura 4 B, F). Excluir a un retorno de la inversión de retorno de la inversión B para asegurar un análisis de sólo el citoplasma. Definir la mitocondria como región objetivo I y DJ1 como objetivo la II Región (Figura 4 C, G). Analizará las imágenes utilizando el bioapplication perfiles neuronales (Cellomics, ThermoFisher) para rastrear la longitud media de las neuritas de la tinción de la tubulina β-III (Figura4D, H). Placas de imagen con la Opera LX automático confocal lector (Perkin-Elmer). Imagen de un total de 30 campos por bien con la lente del objetivo 60x con inmersión en agua. Visualizar las mitocondrias con el láser de 561 nm y los núcleos de excitación UV. Analizará las imágenes utilizando el Spot-Edge-Ridge (SER), con textura algoritmo características. El filtro de SER-Ridge transmite la intensidad de píxeles que forman como patrones de canto. Cuanto más fragmentado de la mitocondria, mayor será la puntuación SER-Ridge (Figura 8). 6. La normalización de datos y análisis Importar los datos desde el software de análisis de imagen en el BioConductor CellHTS2 paquete para el entorno de software R (R versión 2.11.1, la versión BioConductor 2.6). Logaritmo de base (2) transformar los datos antes de la placa por medio de normalización basado en 27, 28. No aplique el ajuste de variación por placa. Para identificar los modificadores del fenotipo, utilizar un ANOVA de dos vías entre los diferent grupos de tratamiento, es decir las células no tratadas infectadas revueltos vs revueltos células tratadas frente a la toxina células diana del gen no tratados frente a las células diana del gen tratado (figuras 5-7). 7. Los resultados representativos Las mutaciones en DJ1 dar lugar a la aparición temprana-recesivo parkinsonismo 21, pero no está claro cómo la pérdida de DJ1 da lugar al fenotipo de la enfermedad. Se sabe que las células deficientes de DJ1 son más susceptibles a la muerte celular oxidativo inducido por el estrés y en respuesta al estrés oxidativo, DJ1 transloca desde el citoplasma a la mitocondria 29, 30. Mediante la construcción de los ensayos de HC para controlar estos fenotipos, podemos identificar los genes que regulan o afectan fenotipos asociados a DJ1. Este enfoque puede ayudar a descifrar los caminos dentro de la cual DJ1 funciones y que podrían estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad. Ejemplo de una interacción con epistáticos DJ1 (Figura 5): Derribo de DJ1 en las células expuestascon los resultados de toxinas en una mayor pérdida de la viabilidad celular (BAR-B: imagen-B) en comparación con las células infectadas con revueltos lentivirus (BAR-A: imagen-A). Derribo de un gen diana tiene un efecto similar a la observada en las células con una caída DJ1 (BAR-C: imagen-C). Derribo de dos DJ1 y un gen diana resulta en una pérdida mucho mayor de la viabilidad celular de la pérdida de genes, ya sea solo (BAR-D:-D la imagen). Esto sugiere una interacción entre epistáticos DJ1 y la meta de genes A. Ejemplo de un gen regulador DJ1 translocación (Figura 6): Cuando las células son expuestas a una toxina, DJ1 transloca desde el citoplasma a las mitocondrias, que se cuantifica mediante un coeficiente más elevado solapamiento entre DJ1 y las mitocondrias (BAR-A: A versus imagen BAR-C: la imagen C). En las células B, donde ha sido la meta de genes silenciados, menos DJ1 transloca a la mitocondria en las células son expuestas a la toxina. Esto sugiere que el objetivo B gen está involucrado en el transporte de DJ1 a la mitocondria. (BAR-B: imagen B y D-BAR: la imagen D) Ejemplo de un gen involucrado en consecuencia neuronal (Figura 7): Derribo de C del gen diana en el medio silvestre de tipo SH-SY5Y células da como resultado un aumento significativo de la duración de neuritas (BAR-B: imagen-B) en comparación con las células infectadas por lentivirus que expresan revueltos shRNA (BAR-A: imagen A). Este efecto se pierde en las células incubadas con la toxina (BAR-C y D). Ejemplo de un gen involucrado en la morfología mitocondrial (Figura 8): La infección de tipo salvaje células SH-SY5Y con ARNhc objetivo gen D produce una disminución en el valor de la segmentación mitocondrial SER-Ridge (Figura 8, C y D de la imagen) en comparación con las células infectadas por lentivirus revueltos (Figura 8, A y B de la imagen). Figura 1 Esquema del protocolo automatizado de cultivo de células.: ntent "> Figura 2 Presentación esquemática del proceso de selección, análisis de imágenes y los métodos estadísticos utilizados durante el proceso de selección:. I) Las células se cultivan hasta que son confluentes y posteriormente sembraron en las placas de ensayo que contiene los lentivirus shRNA. Las células se diferencian durante 5 días y la toxina se añade a las placas durante 24 horas. Las placas de ensayo se emiten desde el sistema y immunostained. La cantidad de tiempo necesario para que cada uno de los procesos se indica entre paréntesis. ii) Los datos se realiza a través una cámara HC (la viabilidad celular, la translocación de proteínas y extensión neuronal) y un sistema automatizado de imágenes confocal (morfología mitocondrial). Los datos son exportados a CellHTS2 paquete en R, base (2) transformación logarítmica y normalizado. ANOVA de dos vías se utiliza para identificar las interacciones significativas entre las diferentes variables. <p class = "jove_content"> Figura 3. Composiciones de imágenes de células adquirida por HC imágenes. A) Las células no tratadas, B) Las células tratadas con H 2 O 2. DJ1 tiene la etiqueta de color verde, las mitocondrias en rojo y los núcleos en azul. Tinción neuritas no está resaltado. Figura 4. Cuantificación de varias funciones celulares obtenidos a partir de una HCS. AD) no se trata SH-SY5Y células. EH) H 2 O 2 tratados con las células SH-SY5Y. A, E) Los núcleos de segmentación y definición de retorno de la inversión A, B, F) Identificación y cuantificación de las mitocondrias B, retorno de la inversión, C, G) Identificación de DJ1, Target del canal II, D, G) La identificación y el cálculo de la longitud de las neuritas promedio. Las células cerca de la orilla de la imagen son excluidos del análisis. Imágenes en los recuadros son las imágenes antes del análisis. <imgalt > Figura 5. La identificación de un gen en epistasis con DJ1 (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas con Mitotracker CMXRos (rojo) que se utilizó para la cuantificación de la salud celular. Figura 6. La identificación de un gen regulador DJ1 translocación (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas por DJ1 (verde), las mitocondrias (rojo) y núcleos (azul) que se utilizaron para la cuantificación de DJ1 translocación a la mitocondria. Figura 7. Identificación de un gen involucrado en consecuencia neuronal (letras en las barras corresponden a las letras en las imágenes). Imágenes de la A a D son SH-SY5Y células marcadas para la β-tubulina III (verde) y núcleos (azul) que se utiliza para la cuantificación de la longitud de las neuritas. Figura 8. La identificación de un gen implicado en la regulación de la morfología mitocondrial. Imagen de A y C son imágenes compuestas de SH-SY5Y células infectadas con revuelto ARNhc o un objetivo del shRNA gen D, respectivamente. Las mitocondrias son de color rojo, mientras que los núcleos son de color azul. Imagen B y D son las visualizaciones de la cuantificación SER-Ridge.