Nous décrivons une méthodologie combinant la culture cellulaire automatisé à haute teneur en imagerie pour visualiser et quantifier les multiples processus cellulaires et des structures, de manière à haut débit. De telles méthodes peuvent aider dans l'annotation fonctionnelle des génomes d'autres ainsi que d'identifier des réseaux de gènes des maladies et de cibles thérapeutiques potentielles.
L'annotation fonctionnelle des génomes, la construction de réseaux moléculaires et l'identification des cibles de nouveaux médicaments, sont des défis importants qui doivent être traitées comme une question de grande urgence 1-4. De multiples approches complémentaires en «omique» ont fourni des indices sur les facteurs de risque génétiques et les mécanismes pathogéniques sous-jacente de nombreuses maladies neurodégénératives, mais la plupart des conclusions ont encore besoin de validation fonctionnelle 5. Par exemple, une étude récente du génome entier pour l'association maladie de Parkinson (PD), a identifié plusieurs nouveaux loci comme facteurs de risque pour la maladie, mais la variante sous-jacente responsable (s) ou mécanisme pathogène n'est pas connue 6, 7. Comme chaque région associée peut contenir plusieurs gènes, l'évaluation fonctionnelle de chacun des gènes sur les phénotypes associés à la maladie, en utilisant les techniques traditionnelles de biologie cellulaire serait trop long.
Il ya aussi un besoin de comprendre les réseaux moléculaires qui pointentmutations génétiques à l'phénotypes qu'ils causent. Il est prévu que les phénotypes des maladies sont le résultat d'interactions multiples qui ont été perturbés. Reconstruction de ces réseaux moléculaires en utilisant des méthodes traditionnelles prendrait beaucoup de temps. Par ailleurs, les prévisions du réseau à partir d'études indépendant de composants individuels, l'approche réductionniste, ne sera probablement sous-estimer la complexité de 8 réseau. Cette sous-estimation pourrait, en partie, expliquer le faible taux de réussite de l'approbation des médicaments en raison d'effets secondaires indésirables ou toxiques. Gagner un point de vue du réseau de sentiers des maladies liées à l'aide HT / HC approches de dépistage cellulaire, et d'identifier les nœuds clés au sein de ces voies, pourrait conduire à l'identification de cibles qui sont plus adaptés pour l'intervention thérapeutique.
Criblage à haut débit (HTS) est une méthode idéale pour répondre à ces questions 9-12. mais les méthodes traditionnelles ont été unidimensionnel tests cellulaires entiers ainsi, celui utilisé simpliSTIC pour les affichages de processus biologiques complexes. Ils ont été incapables de quantifier simultanément les phénotypes observés dans de nombreuses maladies neurodégénératives telles que les déficits du transport axonal ou des altérations dans 13 propriétés morphologiques, 14. Cette approche ne pouvait pas être utilisée pour étudier la nature dynamique des processus cellulaires ou des événements pathogènes qui se produisent dans un sous-ensemble de cellules. Pour quantifier ces caractéristiques on doit passer au multi-dimensionnelle phénotypes appelés à haute teneur de dépistage (HCS) 4, 15-17. HCS est la quantification des cellules à base de plusieurs processus simultanément, ce qui fournit une représentation plus détaillée de la réponse cellulaire aux perturbations par rapport aux différentes HTS.
HCS a de nombreux avantages sur HTS 18, 19, mais faire un haut-débit (HT)-haut contenu (SC) l'écran dans des modèles neuronaux est problématique en raison de coûts élevés, la variation de l'environnement et l'erreur humaine. Afin de détecter les réponses cellulaires sur un «Phenomic« échelleen utilisant l'imagerie HC on doit réduire la variation et l'erreur, tout en augmentant la sensibilité et de reproductibilité.
Ici, nous décrivons une méthode précise et fiable pour mener des écrans shRNA utilisant la culture cellulaire automatisé 20 et HC imagerie dans des modèles cellulaires neuronales. Nous décrivons comment nous avons utilisé cette méthode pour identifier des modulateurs pour une protéine particulière, DJ1, qui, lorsqu'il est muté entraîne autosomique récessive parkinsonisme 21.
Alliant la polyvalence de l'imagerie avec des méthodes HC HT, il est possible de quantifier avec précision une pléthore de phénotypes. Ce pourrait ensuite être utilisé pour faire avancer notre compréhension du génome, les voies impliquées dans la pathogenèse de la maladie ainsi que d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles.
Avec la baisse des coûts de HT / HC systèmes de criblage cellulaire, combinée à la disponibilité de puissants outils de l'échelle du génome de modifier la fonction des gènes, HT / HC écrans deviennent monnaie courante dans les milieux universitaires. L'approche a déjà été appliquée avec succès dans divers domaines de recherche tels que l'identification des cibles médicamenteuses dans le cancer 9, 31-33 et 34-36 et le développement embryonnaire a même potentiel d'application dans le déchiffrement des voies impliquées dans les troubles neuropsychiatriques 37,38. Cependant la mise en œuvre d'un tel système nécessite un investissement important de temps et d'effort avec l'optimisation des processus prenant souvent un minimum de 6 mois. Toutes les étapes, comme les temps de traitement à la trypsine, les vitesses de pipetage et les densités de semis doivent être ajustées, afin de s'assurer que les cellules sont saines et une croissance régulière. Prévention de la contamination bactérienne est l'un des défis les plus difficiles de culture cellulaire automatisé avec des protocoles de nettoyage hebdomadaires dans combination avec constante de rinçage de toutes les lignes portant liquides avec de l'éthanol à 70% étant nécessaire pour les cultures sans contamination. Il sera également nécessaire d'améliorer la robotique afin que les instruments supplémentaires, tels que les microscopes confocaux pour une meilleure résolution et des congélateurs à -80 ° C pour le stockage composé peut être intégré.
Il ya aussi des limites qui doivent être abordées pour améliorer la sensibilité, la vitesse et l'utilité de cette méthode pour étudier les réseaux de gènes et d'identifier les gènes impliqués dans les voies pathogènes moléculaires.
Pour effectuer un écran HT / HC et s'assurer que les données fiables sont recueillis, plusieurs aspects doivent être optimisés. Tout d'abord, la fiabilité de la mesure est primordiale et dépend de la robustesse et la sensibilité du dosage. Par exemple, les tests décrits ci-dessus sont adaptés pour les petits écrans, mais sont difficiles à mettre en œuvre à l'échelle du génome entier, en raison d'étapes de traitement avant le nombre requis d'acquisition d'image.Ainsi, on aurait pu construire des lignées cellulaires stables exprimant le gène rapporteur, ce qui permettrait à l'imagerie directe et conduire à des variations diminué en raison du nombre réduit d'étapes de traitement. A l'heure actuelle, la conception d'un test qui décrit avec précision et quantifie de manière fiable un phénotype d'intérêt est un obstacle majeur dans le processus de dépistage HC.
De nombreux écrans sont menées dans les cellules de mammifères en utilisant différentes bibliothèques d'ARNi, qui souffrent d'effets hors-cible, l'efficacité limitée silençage génique et la couverture du génome incomplet. Ainsi les bibliothèques doivent être faites, qui sont plus spécifiques, puissants et ont une meilleure couverture. Des efforts sont en cours pour créer un tel il est à espérer de tels efforts permettront d'améliorer la reproductibilité des HT / HC SCRE fr hits.
Une limitation de nombre de grands écrans de cellules échelle basée sont qu'elles sont conduites dans les cellules de neuroblastome parce qu'elles peuvent être manipulées génétiquement et cultivé à un grand nombre avec une relative facilité. Cependant, la pertinence des «hits» identifiés dans des modèles ex vivo de culture cellulaire pour la fonction in vivo est discutable, surtout que le cerveau se compose de types de cellules hautement spécialisées qui forment un réseau dense et complexe de connexions synaptiques de fonctionner comme une unité hautement intégrée. En conséquence, il est fréquent que les coups identifiées en utilisant la méthode de dépistage décrite ci-dessus, sont validées en utilisant des techniques d'écrans secondaires additionnels et dans plus physiologique des modèles pertinents 39. Pour améliorer la traduction des hits identifiés lors de HCS, des modèles plus représentatifs et plus sophistiquées, telles que des cellules primaires et des cellules souches différenciées ou de co-culture de systèmes ont besoin d'être développé et adapté pour HT / HC approches.
ntent "> Avec une combinaison de culture cellulaire automatisé et HC imagerie, on peut rapidement gagner de nouveaux aperçus sur le fonctionnement des neurones et de déterminer quelles voies sont importantes pour le développement des maladies. Combinant HCS / HTS données avec des informations générées par d'autres approches en« omique », il sera alors possible de construire une vue d'ensemble la biologie des systèmes des maladies du cerveau, facilitant ainsi le développement thérapeutique.The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les programmeurs et les spécialistes de Hamilton pour le soutien continu et Blaas Eva pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par deux subventions d'investissement NWO (911-07-031 et 40-00506-98-10011), Le Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 et les neurosciences Campus Amsterdam; SJ est soutenu par Ti-Pharma: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |