우리는 높은 처리량 방식으로, 여러 세포 프로세스와 구조를 시각화하고 수치 높은 콘텐츠를 이미지로 자동 셀 culturing를 결합 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 genomes의 추가 기능 주석의 도움뿐만 아니라 질병 유전자 네트워크 및 잠재적 약물 표적을 식별할 수 있습니다.
genomes의 기능 주석, 분자 네트워크 및 소설 약물 표적 식별 건설은 아주 위급 1-4 문제로 해결되어야 할 중요한 과제입니다. 여러 보완 'omics'접근 방식은 유전 위험 요소 및 여러 neurodegenerative 질병을 기본 병원성 메커니즘에 대한 단서를 제공하지만, 대부분의 결과는 아직 기능 검증 5가 필요합니다. 예를 들어, 파킨슨병 (PD), 질병에 대한 위험 요인으로 식별 많은 새로운 loci하지만, 기본 원인이되는 변종 (S) 또는 병원성 메커니즘에 대한 최근의 게놈 넓은 협회 연구는 6, 7을 알 수 없습니다. 각 관련 영역에 여러 개의 유전자를 포함하는 수 있듯이, 전통적인 세포 생물학 기법을 사용하여 질병와 관련된 phenotypes에있는 유전자의 각의 기능 평가 너무 오래 걸립니다.
분자 네트워크를 이해하는 필요도있다는 것을 링크그들은 원인 phenotypes에 유전 변이. 그것은 질병 phenotypes이 중단되었습니다 여러 상호 작용의 결과 것으로 기대된다. 전통적인 분자 방법을 사용하여 이러한 네트워크의 재건은 시간이 소요됩니다. 또한, 개별 구성 요소의 독립적인 연구, reductionism 방식에서 네트워크 예측은 아마 네트워크의 복잡 8 과소 평가합니다. 이 싼 견적이 부분에서 원하지 않는 또는 독성 부작용으로 인해 약물 승인의 낮은 성공률을 설명할 수 있습니다. HT / HC 세포 검사 방법을 사용하여 이러한 경로 내에서 핵심 노드를 식별하는 질병 관련 경로의 네트워크 관점을 확보하면, 치료 개입에 대한 더 적합한 목표의 식별을 초래할 수 있습니다.
하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 9-12 이러한 문제를 해결하기 위해 이상적인 방법입니다. 하지만 전통적인 방법은 simpli를 사용하여 1 차원 전체 – 음 세포 assays, 있었다stic 복잡한 생물 학적 과정에 대한 설치 했어요. 그들은 동시에 같은 형태의 속성 13, 14 axonal 교통 결손 또는 변경과 같은 neurodegenerative 질병에서 관찰 많은 phenotypes를 정할 수 없습니다. 이 접근법은 세포의 일부에서 발생 셀룰러 프로세스 또는 병원성 사건의 동적 특성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다. 하나가 다차원 phenotypes로 이동이 이러한 기능을 계량하기 위해서는 높은 콘텐츠 심사 (HCS) 4, 15-17을 칭했다. HCS는 HTS에 비해 다양한 perturbations에 대한 세포 반응의 자세한 표현을 제공하는 동시에 여러 프로세스의 세포 기반 부량입니다.
HCS는 HTS 18, 19 이상의 많은 장점을 가지고 있지만,의 연결 모델에 높은 처리량 (HT) – 높은 콘텐츠 (HC) 화면을 실시하는 것은 인해 높은 비용, 환경 변화와 인간의 오류로 문제가있다. 'phenomics'규모의 세포 반응을 감지하기 위해HC 이미지 하나를 사용하여 감도와 재현성을 증가하는 동안 변화하고 오류를 줄일 수있다.
여기에 우리는 정확하고 안정적으로 세포의 연결을 모델로 자동 세포 culturing 20 HC 이미징을 사용하여 shRNA 화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 변이된 것은 autosomal 열성 parkinsonism 21 원인이 하나의 특정 단백질, DJ1에 대한 모듈 레이터를 식별하는이 방법론을 사용한 방법에 대해 설명합니다.
HT의 방법으로 HC 이미징의 융통성 결합, 그것은 정확하게 phenotypes의 과다를 정할 수 있습니다. 이것은 이후에뿐만 아니라 잠재적인 치료 표적을 식별로 게놈에 대한 우리의 이해, 질병 pathogenesis에 관련된 경로를 사전에 활용 수 있습니다.
유전자 기능을 수정하는 강력한 게놈 – 광범위한 도구의 가용성과 함께 HT / HC 세포 검사 시스템의 비용 감소와, HT / HC 화면 학계에서 일상지고 있습니다. 접근 방식은 이미 성공적으로 이러한 암 9, 31-33 및 34-36 배아 개발의 약물 표적의 식별과 같은 연구의 다양한 분야에 적용되고 심지어 neuropsychiatric 장애 37,38에 관련된 경로를 파악의 응용 프로그램에 대한 잠재력을 갖고있다. 그러나 이러한 시스템의 구현은 시간과 종종 6 개월 최소 복용 공정 최적화를 통해 노력의 상당한 투자를 필요로합니다. 이러한 trypsinization 시간, pipetting 속도와 시딩 밀도 등 모든 단계는 세포가 건강한 것을 확인하고 지속적으로 성장하기 위해 조정해야합니다. 세균 오염의 방지는 C에서 매주 청소 프로토콜과 자동 세포 배양을 직면하고있는 가장 어려운 문제 중 하나입니다오염 무료로 문화가 필요하고 70 % 에탄올로 모든 액체 베어링 라인 rinsing 상수와 ombination. 그것은 로봇을 향상시키기 위해 또한 필요합니다 그래서 이러한 높은 해상도와 -80 화합물 스토리지 ° C 냉동고가 통합될 수에 대한 공촛점 현미경 같은 추가 악기.
유전자 네트워크를 연구하고 병원성 분자 경로에 관련된 유전자를 확인하기 위해이 방법의 민감한, 속도 및 유틸리티를 개선하기 위해 해결되어야 할 한계도 있습니다.
HT / HC 화면을 실시하고 신뢰할 수있는 데이터가 수집되었는지 확인하기 위해 몇 가지 측면 최적화해야합니다. 첫째, 측정의 신뢰도는 파라마운트이며, 분석의 견고하고 감도에 의존적일 수 밖에 없습니다. 예를 들어, assays 위에서 설명한 작은 화면에 적합하지만, 인해 이미지 수집하기 전에 필요한 숫자 처리 단계에 게놈 넓은 규모에 구현하기가 어렵습니다.따라서, 하나는 직접 영상에 대한 허용 및 가공 단계의 수를 감소로 인해 감소 변화로 이어질 것입니다 리포터 유전자를 표현하는 안정적인 세포 라인을 구축해야합니다. 현재 정확하게 묘사하고 안정적으로 관심 표현형이 HC 심사 과정에서 주요 병목이다 quantifies 분석을 설계.
많은 화면은 오프 대상 효과, 제한된 유전자 입을 효율성 및 불완전한 게놈 범위에서 고통받는 모든 것 중에서 다른 RNAi 라이브러리를 사용하여 포유류 세포에서 실시하고 있습니다. 따라서 도서관은보다 구체적인, 강력한하고 더 나은 범위를 보유하고있는하여야합니다. 노력은 만들 진행 등 그것은 이러한 노력은 HT / HC scre의 재현성을 향상시킬 계획이다 욕실 안타.
그들은 유전자 상대적으로 쉽게 조작 및 대형 숫자 교양 수 있기 때문에 많은 대형 셀 기반 화면의 제한은 그들이 neuroblastoma 세포에서 실시한다는 점입니다. 그러나, 생체내 기능에 전 (前) 생체내 세포 배양 모델에서 확인된 '히트'의 관련성이있는 두뇌는 고도로 통합된 단위로 기능 시냅스 연결의 밀도와 복잡한 네트워크를 형성 고도로 전문화된 세포 유형으로 구성되어 있습니다 특히, 의심됩니다. 그 결과로서, 그것은 위에서 설명한 심사 접근법을 사용 식별, 추가 기술을 사용하여 보조 화면에서보다 생리 관련 모델을 39 확인 아르 안타 것이 일반적입니다. HCS 동안 확인된 히트의 번역을 개선하기 위해 이러한 기본 세포와 차별화된 줄기 세포 또는 공동 문화 시스템과 같은 더 많은 대표와 정교한 모델 개발 및 HT / HC 방식에 맞게해야합니다.
자동 세포 culturing 및 HC 이미지 하나의 조합 ntent "> 빠르게 뉴런이 작동하는 방법에 새로운 통찰력을 얻고있는 경로는 질병 개발에 중요하다. 다른 'omics'접근 방식에서 생성된 정보와 HCS / HTS 데이터를 결합하여 확인할 수 있습니다, 그것은 것입니다 그리고 따라서 치료 개발을 촉진, 뇌 질환의 시스템 생물학의 개요를 구축하는 것이 가능합니다.The authors have nothing to disclose.
우리는 기술 지원에 대한 지속적인 지원과 에바 Blaas에 대한 해밀턴 프로그래머와 전문가를 주셔서 감사합니다. T5 – 207 : SJ는 티 – 제약에 의해 지원되며이 작품은 두 NWO 투자 보조금 (911-07-031 및 40-00506-98-10011), Prinses이 Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 신경 과학 캠퍼스 암스테르담에 의해 지원되었다.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |