神経変性疾患におけるハイコンテントスクリーニング

1。自動化された接着細胞培養のプロセス（図1）20 細胞培養プレートの入力のための自動細胞培養システムを準備します。負荷の消耗品（例えば、ピペットチップ、細胞培養プレート、アッセイプレート）のグラフィカルユーザーインタフェース（GUI）を使用してシステムに。十分な細胞培養培地があることを確認、リン酸塩は、ロボットシステムでは生理食塩水（PBS）とトリプシンをバッファ。 SH – SY5Y神経芽細胞腫細胞株のプレート当たり2 × 10 6細胞、と手動でシードtwo omnitrayプレート。 10％ウシ胎児血清（FBS）とのOpti – MEMで細胞を維持する。 GUIを使用して細胞培養ロボットにプレートを置く。細胞は37℃、5％CO 2でインキュベートされます。 文化のプロトコルが20を開始する必要があるどのセルを選択します。一つは、接着細胞の培養プロセス22からマウスフィーダー細胞23またはサスペンションセルの培養で培養し、胚性幹（ES）細胞の増殖を選択できます。LS 22。 接着細胞培養のプロトコール（図1）を選択し、接着細胞株固有のパラメータファイルが合流しきい値（細胞が含まれているomnitray板の面積）は70％に設定されているように調整されていることを確認。 2分に総トリプシン処理の時間を設定します。 プレート当たり2 × 10 6細胞の播種細胞数で、新しいomnitrayプレートを準備するためにロボットに指示します。 自動化された接着細胞培養のプロトコール（図1）を用いて細胞培養系への入力omnitrayプレート。このプロトコルは、次のステップが含まれます：彼らが事前に定義された合流のしきい値に達するまで、プレートをインキュベートし、撮像される。細胞は5測定値内で合流しきい値に到達しない場合、プレートはシステムから削除されます。ユーザー定義の合流のしきい値に達すると、細胞は、洗浄しトリプシン処理し、カウントされます。細胞のあらかじめ定義された番号は、新しいomnitrayプレートに添加し、細胞に十分な数がある場合、指定された麻痺しているアッセイプレートのERは、デッキに運ばれ、細胞の定義数は、各ウェルに分配されています。アッセイプレートは、直接、さらなる処理のためのシステムから統合された顕微鏡または出力を用いて画像化することができます。 ウェルあたり5,000細胞の総数と、omnitrayプレートあたり4アッセイプレートを準備するためにシステムに指示します。 2。アッセイプレートへのshRNAのウイルス産生とメッキ（所要時間：6日間） アンピシリン100μg/ mlの（Sigma – Aldrich社）を含むLuria -ベルターニ媒体のメディアの2ミリリットルで一晩shRNAベクター（オープンバイオシステムズ、TRC1）を含む細菌のグリセロールストックを成長する。 製造者のプロトコール（プロメ​​ガウィザードMagneSil TFX）以下のプラスミドを抽出します。 RNAiのコンソーシアムハイスループットレンチウイルス生産（96ウェルプレート）プロトコル24を使用してウイルスを生成。形質導入のために使用されるウイルス粒子は複製欠損しているため、レンチウイルスとの作業は、比較的安全です、分割遺伝子の包装戦略は、その生産に使用されます。しかし、レンチウイルスで作業する場合、追加の生物学的安全性手順では、自分と他人25〜リスクを最小限にするために必要です。すべての実験はMLIIまたはBSL2の安全レベルの実験室で行われなければならない。レンチウイルス粒子と接触しているすべてのプラスチックは（ピペット、プラスチック製の皿、メディア）廃棄前に24時間漂白剤とインキュベートしてください。 プラスミドpLKO.1 GFPを（Sigma – Aldrich）を用いてGFP陽性細胞の割合を決定することにより、レンチウイルスの感染の多重度（MOI）を計算します。 MOI 3でアッセイプレートにプレートのレンチウイルス、。 3。レンチウイルス形質導入およびSH – SY5Y細胞（所要時間：6日間）の神経分化細胞をアッセイプレート（ステップ1.7参照）に追加されます。自動細胞培養システムへのshRNAレンチウイルスを含むアッセイ用プレートをロードする。 上で24時間後に、メディアアッセイプレートは、分化のプロセスを開始するために0.5％FBS、0.1μMレチノイン酸を含むのOpti – MEMに変更されます。 SH – SY5Y細胞の分化は、神経突起構造の可視化を可能にし、細胞分裂を同期させます。 5日間分化のメディアでアッセイプレートのインキュベーションを続ける。これは、標的遺伝子の発現の最大のノックダウンを保証します。 5日目に、ミトコンドリアにDJ1の転座を刺激する24時間アッセイプレートの半分に50μMのH 2 O 2を加える。 6日目に、ウェル当たり200nMの最終濃度で、細胞にMitoTrackerによりのCmxROS（Invitrogen）を追加し、37℃で30分間。 一つは、直接HCイメージャまたはプレートがさらなる処理のためのシステムからエクスポートすることができますを使用して画像板にシステムに指示することができます。 4。アッセイプレートの自動免疫染色（所要時間：2日間） 画質はparamounです高感度かつ信頼性の高いHCSを実施するためのT。不正確なピペッティングによる細胞の単分子層へのダメージは、画質の悪さや再現不可能な結果につながることができます。細胞層の損傷を最小限にするために、免疫染色は、ロボットステーションを用いて行った。プロシージャは、以前に26を説明してきたものと似ていますが、スループットを向上させ、消耗品使用量を減らすためにカスタマイズされています。 4％パラフォルムアルデヒド37に予め温めておいた100μlの℃で細胞を固定室温で20分間インキュベートする。 5分間、3回PBS200μlで細胞を洗浄。 PBSで10分間0.1％トリトン（PBST）を含む200μlのアッセイプレートをインキュベートする。 5分間、3回PBS200μlで細胞を洗浄。 室温で1時間ブロック緩衝液200μl（5％FBSとPBST）でアッセイプレートをインキュベートする。 5分間、3回PBS200μlで細胞を洗浄。 follでインキュベート一晩4により一次抗体° C： ヤギDJ1 N20（サンタクルス、5μg/ ml）をウサギβ- IIIチューブリン（Sigma – Aldrich社、1μg/ mlの） 次の日に、5分間、3回PBS200μlで細胞を洗浄。 室温で1時間、次の二次抗体でアッセイプレートをインキュベートする。 AlexaFluor 488ロバ抗ヤギ（Invitrogen社、2μg/ ml）を AlexaFluor 647ヤギ抗ウサギ（Invitrogen社、2μg/ mlの 5分間、3回PBS200μlで細胞を洗浄。 10分間、ヘキスト（1μg/ mlのInvitrogen）で培養する。 5分間、3回のために200μlのPBSで細胞を洗浄。 4℃店舗プレートは° Cまで、それらのイメージを作成することができます。 5。高いコンテンツの画像取得と画像解析（所要時間：5日間） 20倍対物レンズを使用しても毎秒30フィールドの全体像。 FIとDJ1を可視化するTCフィルターセット、TRITCフィルターセット、Cy5にフィルタセットとUVフィルターセット（図3）を使用して核をもつβ- IIIチューブリンとミトコンドリア。 ミトコンドリア内MitoTrackerにより信号の平均強度を決定するためにコンパートメント解析のBioapplication（セロミクス、ThermoFisher）を使って画像を分析する。 （図4B、F）。 DJ1とミトコンドリア間の平均のオーバーラップ係数を決定するために、セロミクスColocalisationのbioapplication（セロミクス、ThermoFisher）を使って画像を分析する。次のように関心領域（ROI）を定義します。ROI A – 核（図4A、E）、ROI B – ミトコンドリア（図4 B、F）。唯一の細胞質の分析を確実にするためにROI BからROI Aを除外する。ターゲット地域ターゲット地域II（図4C、G）などのIとDJ1としてミトコンドリアを定義します。 β- IIIチューブリンの染色（図から神経突起の平均長さを追跡するために神経プロファイリングbioapplication（セロミクス、Thermofisher）を使って画像を分析する4D、H）。 オペラLX自動化された共焦点リーダー（パーキンエルマー）を用いて画像のプレート。水の浸漬で60倍対物レンズを使用してもあたり30フィールドの全体像。 UV励起と561 nmのレーザー、核とミトコンドリア可視化する。 スポットエッジリッジ（SER）テクスチャ機能のアルゴリズムを使用して画像を分析する。 SER -リッジフィルタでは、尾根のようなパターンを形成するピクセルの輝度を送信します。より断片化されたミトコンドリア、高いSER -リッジスコア（図8）。 6。データの正規化と解析 Rのソフトウェア環境のBioConductor CellHTS2パッケージ（Rのバージョン2.11.1、BioConductorのバージョン2.6）に画像解析ソフトウェアからデータをインポートします。 を底とする対数（2）あたりのプレートの中央値ベースの正規化27、28の前にデータを変換する。プレートごとの分散の調整を適用しないでください。 表現型の修飾子を識別するために、differeの間に2つ配置ANOVAを使用してくださいNT治療群すなわち感染した未処理の細胞をスクランブル対毒素処理細胞対標的遺伝子未処理の細胞対標的遺伝子処理した細胞を（図5-7）スクランブル。 7。代表的な結果 DJ1内の変異は早期発症、劣性パーキンソニズム21に生じさせるが、それはDJ1の損失は、病気の表現型を生じさせる方法は不明である。それは、DJ1の欠損細胞はより多くの酸化ストレス誘発性細胞死に感受性と酸化ストレス、ミトコンドリア〜29細胞質からDJ1移行し、30に対応していることが知られている。これらの表現型を監視するためにHCのアッセイを構築することによって、我々は、DJ1に関連する表現型を調節するか影響を与える遺伝子を識別することができます。このアプローチは、解読が経路内のDJ1の機能とその疾患の病因に関与することができますすることができます。 DJ1とエピスタシス相互作用（図5）の例：暴露された細胞のDJ1のノックダウン細胞の生存率の大きな損失で毒素の結果に（BAR – B：画像- B）（：画像- BAR -）スクランブルレンチウイルスを感染させた細胞と比較して。標的遺伝子のノックダウンは、DJ1ノックダウン（：画像- C BAR – C）を持つ細胞で観察されたのと同様の効果があります。 DJ1と標的遺伝子の単独遺伝子の損失（：画像- D BAR – D）よりも細胞生存率の有意に高い損失の結果、両方のノックダウン。これはDJ1と標的遺伝子Aの間のエピスタシス相互作用を示唆している細胞が毒素にさらされ、細胞質からミトコンドリアへのDJ1移行し、DJ1とミトコンドリア（BAR -の間に高いオーバーラップ係数によって定量化される：：画像対DJ1転座（図6）を制御する遺伝子の例BAR – C：画像C）。標的遺伝子のBが沈黙している細胞では、以下のミトコンドリアへのDJ1移行して、細胞が毒素にさらされているとき。これは、その標的遺伝子BはミトコンドリアにDJ1の輸送に関与していることを示唆している。 （BAR – B：画像BとBAR – D：画像D） 神経突起（図7）に関与する遺伝子の例：神経突起の長さの大幅な増加で野生型SH – SY5Y細胞の結果の標的遺伝子Cのノックダウン（BAR – B：画像- B）スクランブルを発現するレンチウイルスに感染した細胞に比べてshRNAを（BAR -：画像）。この効果は、毒素（BAR – CおよびD）でインキュベートした細胞では失われている。 ミトコンドリアの形態（図8）に関与する遺伝子の例：に比べてミトコンドリアSER -リッジのセグメンテーションの値（図8、画像CとD）の減少に遺伝子Dの結果をターゲットとしたshRNAと野生型SH – SY5Y細胞の感染細胞は、スクランブルされたレンチウイルス（図8、画像AとB）に感染。 図1自動化された細胞培養プロトコルの概要。。 ntent"> 図2の回路のスクリーニングプロセスの概要を、画像解析やスクリーニングの過程で使用される統計的手法：。彼らはコンフルエントとしたshRNAレンチウイルスを含むアッセイ用プレートに続いてメッキができるまで、i）の細胞を培養している。細胞を5日間分化され、毒素は、24時間プレートに追加されます。アッセイプレートは、システムから出力され、免疫染色。の各プロセスに要する時間の量は、括弧内に示されます。 ⅱ）データは、HCイメージャ（細胞の生存、タンパク質の移行と神経突起伸長）と自動化された共焦点撮像装置（ミトコンドリアの形態）を使用して取得しています。データは、ベースは（2）ログが変換され、正規化、R内CellHTS2パッケージにエクスポートされます。双方向分散分析は、異なる変数の間に有意な相互作用を識別するために使用されます。 <p c小娘="jove_content"> 図3。HCイメージングによって取得された細胞の合成画像。 A）未処理細胞は、B）細胞は、H 2 O 2で処理した。 DJ1は緑、赤と青の核内ミトコンドリアにラベルが付いています。神経突起の染色が強調表示されていません。 図4。HCSから得られるいくつかの細胞機能の定量化。 AD）未処理SH – SY5Y細胞。 EH）H 2 O 2処理されたSH – SY5Y細胞。 ROI Aの、E）原子核のセグメンテーションと定義、ミトコンドリア、ROI BのB、F）の同定と定量、C、G）DJ1の同定、ターゲットチャンネルII、D、G）の平均神経突起の長さの同定と計算。画像のエッジに近い細胞を解析から除外されます。はめ込み画像は、分析前のイメージです。 <imgalt > 図5。DJ1（バー上の文字は、画像上のレタリングに対応）とエピスタシスの遺伝子の同定。画像はDを介して細胞の健康状態の定量化のために使用されたMitoTrackerによりCMXRos（赤）で標識されたSH – SY5Y細胞である。 図6。DJ1転座を制御する遺伝子の同定（棒上の文字は、画像上のレタリングに対応）。画像はDを介してミトコンドリアへDJ1転座の定量化のために使われたミトコンドリアDJ1（緑）、（赤）と核（青）用のラベルSH – SY5Y細胞である。 図7。神経突起伸長に関与する遺伝子の同定（棒上の文字は、画像上のレタリングに対応）。 A〜Dの画像神経突起の長さの定量化のために使用されたβ- IIIチューブリン（緑）と核（青）用のラベルSH – SY5Y細胞である。 図8。ミトコンドリアの形態調節に関与する遺伝子の同定。画像AとCはそれぞれスクランブルshRNAまたはshRNAを標的遺伝子Dに感染したSH – SY5Y細胞の合成画像です。核は青色で着色されている間、ミトコンドリアは赤色に着色される。画像BとDは、SER -リッジの定量化の可視化です。