在神经退行性疾病的高内涵筛选

1。自动贴壁细胞培养过程中（图1） 20 准备自动细胞培养系统，细胞培养板的输入。负载消耗品（如枪头，细胞培养板，实验板）到系统中使用的图形用户界面（GUI）。确保有足够的细胞培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶在机器人系统。 手动种子两个2 × 10 6细胞，每盘的SH – SY5Y神经母细胞瘤细 ​​胞株，omnitray板。 10％胎牛血清（FBS），维持在OPTI – MEM细胞。放入细胞培养，使用GUI机器人的板块。将在37 ° C和5％CO 2孵育细胞。 选择其中细胞培养协议需要发起20。一是可以选择从22日 ，贴壁细胞培养过程中培养和扩大胚胎干细胞（ES细胞）的小鼠饲养细胞 23或悬浮培养CELLS 22。 选择贴壁细胞培养协议（图1），确保贴壁细胞线的具体参数文件进行调整，使合流阈值（包含细胞omnitray板面积）70％。设置总胰酶消化时间为两分钟。 指示准备新omnitray板的机器人，一个2 × 10 6细胞每盘播种细胞数目。 输入到细胞培养系统，使用自动的贴壁细胞培养协议（图1）omnitray板。该协议包括以下步骤：培养板成像，直到他们达到预先定义的汇合门槛。如果细胞没有到达合流阈值，在5个读数板从系统中删除。到达合流用户定义阈值后，细胞被洗净，胰酶消化并计数。预先确定数量的细胞被添加到新omnitray板，如果有足够数量的细胞，指定麻木ER的检测板被运到甲板上，并配发到每口井的细胞定义。检测板可直接使用作进一步处理系统集成的显微镜或输出成像。 指示系统，准备4％omnitray板实验板，与5000细胞，每孔总。 2。 shRNA的病毒生产到检测板电镀（所需时间：6天） 长出甘油菌股票包含的shRNA载体（打开生物系统公司，TRC1）卢里亚- Bertani培养基中含有100微克/毫升，氨苄青霉素（Sigma – Aldrich公司）媒体2毫升过夜。 按照制造商的协议（Promega公司向导马格尼西合金TFX）提取质粒。 产生病毒的RNAi财团高通量慢病毒生产协议（96孔板）24。慢病毒工作是比较安全的，因为病毒颗粒用于转导复制缺陷和分用于其生产的基因包装策略。然而，与慢病毒工作时，更多的生物安全程序是必要的，以尽量减少对自己和他人 25的风险。所有实验必须在MLII或BSL2安全水平实验室进行。使用漂白剂与慢病毒颗粒接触的所有塑料（移液器，塑料菜，媒体）应孵育24小时前处置。 确定使用的pLKO.1 GFP质粒（Sigma – Aldrich公司）的GFP阳性细胞的百分比计算的慢病毒的感染复数（MOI）。 板慢病毒检测板，MOI 3。 3。慢病毒转导和神经元分化的SH – SY5Y细胞（所需时间：6天） 细胞是检测板（见第1.7步）。装载到自动细胞培养系统中包含的shRNA慢病毒的检测板。 24小时后，媒体上检测板将改为OPTI – MEM含0.5％FBS和0.1微米维甲酸开始分化过程。 SH – SY5Y细胞分化允许神经炎结构的可视化和同步细胞分裂。 继续在5天的分化媒体的实验板的孵化。这将确保最大击倒靶基因的表达。 第5天，24小时添加50微米H 2 O 2的实验板的一半，刺激DJ1易位到线粒体。 第6天，添加Mitotracker CmxROS（Invitrogen公司）的细胞，在终浓度为每孔200 nm的37 ° 30分钟。 一个可以指示系统的图像板直接使用的HC图像扫描仪或板可作进一步处理系统出口。 4。自动免疫检测板（所需时间：2天） 图像质量是paramounT进行一个敏感而可靠的HCS。由于不准确的移液细胞单层的损害可能会导致图像质量差和复制的结果。为了最大限度地减少细胞层损坏，使用机器人站进行免疫。程序是类似于先前已描述26，但已定制，以提高吞吐量和降低耗材的使用。 修复细胞的4％多聚甲醛100μL预热至37 ° C。在室温20分钟孵育。 与200μL5分钟，3倍的PBS洗涤细胞。 孵育检测板200μL的PBS含0.1％的Triton（PBST）10分钟。 与200μL5分钟，3倍的PBS洗涤细胞。 块缓冲区在室温下为1小时（含5％FBS PBST）与200μL孵育检测板。 与200μL5分钟，3倍的PBS洗涤细胞。 孵育的FOLL由于抗体4℃过夜° C时： 山羊DJ1的N20（圣克鲁斯，5微克/毫升） 兔β-Ⅲ微管蛋白（Sigma – Aldrich公司，1微克/毫升） 翌日，200μL的PBS洗涤细胞5分钟，3次。 以下的二级抗体1小时在室温下孵育检测板： AlexaFluor 488驴抗山羊（Invitrogen公司，2微克/毫升） AlexaFluor 647羊抗兔（Invitrogen公司，2微克/毫升与200μL5分钟，3倍的PBS洗涤细胞。 用Hoechst（Invitrogen公司; 1微克/毫升）孵育细胞10分钟。 200μLPBS清洗5分钟，3次细胞。 储存于4板° C直到他们可以成像。 5。含量高，图像采集和图像分析（所需时间：5天） 图片共30％以及使用20X物镜领域。可视化的FI DJ1TC过滤器设置，与TRITC的过滤器设置，β-Ⅲ微管蛋白与Cy5的过滤器设置和使用紫外线过滤器设置（图3）的原子核的线粒体。 使用房室分析Bioapplication（Cellomics，T​​hermoFisher），以确定内的线粒体Mitotracker信号的平均强度分析图像。 （图4B，F）。 要确定平均DJ1和线粒体之间的重叠系数，使用Cellomics Colocalisation bioapplication（Cellomics，T​​hermoFisher）的图像进行分析。定义如下的感兴趣区域（ROI）：投资回报率 – 核（图4A，E），乙的投资回报率 – 线粒体（图4的B，F）。排除乙的投资回报率的投资回报率分析，以确保只有细胞质。定义目标区域我作为目标区域II（图4C，G）的DJ1线粒体。 分析图像，使用神经元分析bioapplication（Cellomics，T​​hermofisher）跟踪突起的平均长度从β-Ⅲ微管蛋白染色（图4D，H）的。 使用Opera LX自动焦读者（在Perkin – Elmer）的图像板。图片共30每口井用清水浸泡使用60X物镜领域。可视化线粒体的561 nm激光和紫外光激发的原子核。 使用点边缘岭（SER）纹理特征算法的图像分析。在SER岭滤波器传输形成脊状花纹的像素强度。线粒体较为零散，服务岭得分越高（图8）。 6。数据正常化和分析从图像分析软件的数据导入BioConductor CellHTS2 R软件环境的包（版本2.11.1，2.6版BioConductor）。 对数的底（2）转换数据之前，每盘的中位数为基础正常化27，28 。不适用方差调整每盘。 要确定一个表型的修饰符，使用differe之间的双向方差NT治疗组，即炒感染未经处理的细胞与炒毒素处理的细胞与靶基因的未经处理的细胞与靶基因处理的细胞（图5-7）。 7。代表性的成果内DJ1突变引起发病早期隐性帕金森病21，但目前还不清楚如何DJ1损失引起的疾病表型。据悉，DJ1缺陷的细胞更容易受到氧化应激诱导的细胞死亡和氧化应激，从细胞质DJ1区转移到线粒体29，30 。通过构建慧聪检测监控这些表型，我们可以找出基因，调节或影响与DJ1相关的表型。这种方法可以帮助破译内可在疾病的发病机制涉及DJ1功能和的途径。 上位DJ1互动（图5）例：DJ1击倒在暴露细胞毒素在细胞活力的更大的损失结果（英美B：图像 – B）相比，炒慢病毒感染的细胞（英美答：图像）。击倒一个靶基因有一个类似的效果观察细胞与DJ1击倒（BAR – C – C的图像）。击倒的DJ1和靶基因的细胞活力明显大于损失或基因（BAR – D图像三维）的损失一个结果。这表明上位DJ1和靶基因答：之间的互动基因调节DJ1易位（图6）：当细胞暴露在毒素，DJ1从细胞质区转移到线粒体，这是由一个更高的重叠系数之间的DJ1和线粒体（英美一量化：图像A与范例英美- C影像C）。在沉默靶基因B已被的细胞，少DJ1区转移到线粒体细胞接触到的毒素。这表明，靶基因B是在参与DJ1运输到线粒体。 （BAR – B：图像B和BAR – D图像D） 击倒目标基因C野生型SH – SY5Y细胞在突起长度显着增加的结果：在神经细胞的生长（图7）有关的基因的一个例子（英美B：图像- B）的表达炒慢病毒感染的细胞相比的shRNA（英美答：图像A）。这种效果是失去了细胞毒素（BAR – C和D）。 线粒体形态（图8）有关的基因的例子：野生型的SH – SY5Y细胞与shRNA的目标在减少线粒体的SER岭分割值（图8，图像C和D）基因研发成果感染相比，炒慢病毒（图8，图像A和B）感染的细胞。 图1：自动细胞培养协议的大纲 。 ntent“> 图2的筛选过程中，图像分析和筛选过程中所使用的统计方法原理概述：I）细胞培养，直到他们汇合，并随后进入包含的shRNA慢病毒检测板镀。细胞是有区别的5天中和毒素，然后添加到24小时的板块。检测板从系统输出和免疫染色。括号内的数字为每个进程所采取的时间。 ii）数据使用HC成像仪（细胞活力，蛋白质易位和神经生长）和一个自动化的共焦成像仪（线粒体形态）获得。数据在R CellHTS2包出口基地（2）数转换和规范化。双因素方差分析是用来识别不同的变量之间的显著的相互作用。 <p c姑娘="“jove_content”"> 图3细胞收购慧聪成像的合成图像。一）未经处理的细胞，B与H 2 O 2）细胞治疗。 DJ1标记为绿色，红色和蓝色的细胞核线粒体。突起染色不突出。 图4：从HCS几个细胞功能的定量。 AD）未经处理的SH – SY5Y细胞。 EH）的H 2 O 2处理的SH – SY5Y细胞。 A，E）核分割和投资回报率的定义;的B，F）的识别和量化的线粒体，投资回报率乙，C，G）的DJ1鉴定，第二通道目标; D，G）的鉴定和平均突起长度计算。靠近图像边缘的细胞，是从分析中排除。插入图像，图像分析前。 <imgalt > 图5。DJ1（酒吧字母对应图像刻字）上位基因的鉴定。图片A至D SH – SY5Y细胞，细胞健康的量化Mitotracker CMXRos（红色）标记。 图6。调节DJ1易位（酒吧的字母对应图像刻字）基因的鉴定。图片A至D DJ1（绿色），线粒体（红色）和细胞核（蓝色），用于DJ1易位到线粒体定量标示的SH – SY5Y细胞。 在神经细胞生长有关的基因的鉴定（酒吧字母对应图像刻字）图7 。。 A至D SH – SY5Y细胞β-Ⅲ微管蛋白（绿色）和细胞核（蓝色），突起长度定量使用标记的图像。 图8。识别有关的基因在调节线粒体形态。图片A和C是炒的shRNA或shRNA的基因打靶D分别感染SH – SY5Y细胞的合成图像。线粒体是红色的，而核以蓝色彩色。图片B和D是可视化的服务岭量化。