We beschrijven een methodiek combineert geautomatiseerde cel kweken met een hoog-content imaging te visualiseren en te kwantificeren meerdere cellulaire processen en structuren, in een high-throughput manier. Dergelijke methoden kunnen helpen bij de verdere functionele annotatie van genomen en te identificeren ziektegen netwerken en potentiële drug targets.
De functionele annotatie van genomen, de bouw van de moleculaire netwerken en nieuwe drug target identificatie, zijn belangrijke uitdagingen die moeten worden aangepakt als een zaak van grote urgentie 1-4. Meerdere complementaire 'omics' benaderingen hebben aanwijzingen met betrekking tot de genetische risicofactoren en pathogene mechanismen die ten grondslag liggen aan tal van neurodegeneratieve ziekten, maar de meeste bevindingen moeten nog functionele validering 5. Bijvoorbeeld, is een recent genoom associatie studie voor de ziekte van Parkinson (PD), ook tal van nieuwe loci als risicofactoren voor de ziekte, maar de onderliggende veroorzakende variant (s) of pathogene mechanisme niet bekend is zes, zeven. Aangezien elke regio geassocieerd kan bevatten meerdere genen, zou de functionele evaluatie van elk van de genen op fenotypes geassocieerd met de ziekte, met behulp van traditionele celbiologische technieken te lang duren.
Er is ook een noodzaak om de moleculaire netwerken te begrijpen die verwijzengenetische mutaties aan de fenotypes die ze veroorzaken. De verwachting is dat de ziekte fenotypes zijn het gevolg van meerdere interacties die zijn verstoord. Reconstructie van deze netwerken met behulp van traditionele moleculaire methoden zou tijdrovend zijn. Bovendien zal het netwerk voorspellingen van onafhankelijke studies van de individuele componenten, het reductionisme aanpak, waarschijnlijk een onderschatting van de complexiteit van het netwerk 8. Deze onderschatting kan voor een deel te verklaren het lage slagingspercentage van de goedkeuring van geneesmiddelen als gevolg van ongewenste of toxische bijwerkingen. Het verkrijgen van een netwerk perspectief van ziekte gerelateerde paden met behulp van HT / HC-cellulaire screening benaderingen, en het identificeren van de belangrijkste knooppunten binnen deze paden, zou kunnen leiden tot de identificatie van targets die meer geschikt zijn voor therapeutische interventie.
High-throughput screening (HTS) is een ideale methode om 9-12 aanpakken van deze problemen. maar de traditionele methodes werden eendimensionale whole-cell assays goed, dat vereenvoudigd wordt gebruiktstic uitlezingen voor complexe biologische processen. Ze waren niet in staat om gelijktijdig kwantificeren van de vele fenotypes waargenomen in neurodegeneratieve ziekten zoals axonaal transport tekorten of wijzigingen in morfologie eigenschappen van 13, 14. Deze aanpak kan niet worden gebruikt om het dynamische karakter van cellulaire processen of pathogene gebeurtenissen die zich voordoen in een subset van cellen te onderzoeken. Te kwantificeren dergelijke functies moet men om te verhuizen naar multi-dimensionale fenotypes genoemd high-content screening (HCS) 4, 15-17. HCS is de cel-gebaseerde kwantificering van meerdere processen tegelijk, die een meer gedetailleerde weergave van de cellulaire respons op verschillende verstoringen biedt ten opzichte van HTS.
HCS heeft veel voordelen ten opzichte van HTS 18, 19, maar het uitvoeren van een high-throughput (HT)-high-inhoud (HC) scherm in neuronale modellen is problematisch vanwege de hoge kosten, milieu-variatie en menselijke fouten. Om de cellulaire respons te detecteren op een 'phenomics' schaalmet behulp van HC beeldvorming moet men variatie en fouten te verminderen, terwijl het verhogen van de gevoeligheid en reproduceerbaarheid.
Hierin beschrijven we een methode om nauwkeurig en betrouwbaar gedrag shRNA schermen met behulp van geautomatiseerde cel-kweken van 20 en HC imaging in neuronale cellulaire modellen. Beschrijven we hoe we deze methodologie gebruikt om modulatoren te identificeren voor een bepaald eiwit, DJ1, die, wanneer gemuteerd veroorzaakt autosomaal recessief parkinsonisme 21.
De combinatie van de veelzijdigheid van de HC-beeldvorming met HT methoden, is het mogelijk om nauwkeurig te kwantificeren een overvloed aan fenotypes. Dit kan vervolgens worden gebruikt om ons begrip van het genoom, de routes die betrokken zijn bij de ziekte pathogenese vooraf evenals het identificeren van potentiële therapeutische doelen.
Met de dalende kosten van de HT / HC-cellulaire screening systemen, in combinatie met de beschikbaarheid van krachtige genoom-brede instrumenten om genfunctie te wijzigen, zijn HT / HC schermen steeds gemeengoed in de academische wereld. De aanpak is al met succes toegepast op diverse gebieden van onderzoek, zoals de identificatie van targets voor geneesmiddelen bij kanker 9, 31-33 jp 34-36 embryonale ontwikkeling en heeft zelfs mogelijkheden voor toepassing in het ontcijferen van de wegen die betrokken zijn bij neuropsychiatrische stoornissen 37,38. Maar de uitvoering van een dergelijk systeem vergt een aanzienlijke investering van tijd en inspanning met procesoptimalisatie vaak het nemen van een minimum van 6 maanden. Alle stappen, zoals behandeling met trypsine keer, pipetteren snelheden en seeding dichtheden moeten worden aangepast, om ervoor te zorgen dat cellen gezond zijn en consistent te groeien. Preventie van bacteriële besmetting is een van de moeilijkste uitdagingen voor geautomatiseerde cel-cultuur met wekelijkse schoonmaak protocollen in combination met een constante spoelen van alle vloeibare peilingslijnen met 70% ethanol noodzakelijk voor de verontreiniging gratis culturen. Het zal ook nodig zijn om de robotica te verbeteren, zodat aanvullende instrumenten, zoals de confocale microscopen voor een hogere resolutie en -80 ° C diepvriezers voor samengestelde opslag kan worden geïntegreerd.
Er zijn ook beperkingen die moeten worden gericht aan de gevoelige, de snelheid en het nut van deze methode gebruiken om gen-netwerken bestuderen en identificeren van genen betrokken bij pathogene moleculaire pathways te verbeteren.
Voor het uitvoeren van een HT / HC-scherm en ervoor zorgen dat betrouwbare gegevens worden verzameld, een aantal aspecten rekening te worden geoptimaliseerd. De eerste, de betrouwbaarheid van de meting staat voorop en is afhankelijk van de robuustheid en de gevoeligheid van de test. Bijvoorbeeld, de testen hierboven beschreven zijn geschikt voor kleinere schermen, maar zijn moeilijk te implementeren op een genoom-wijde schaal, door het aantal verwerking stappen die nodig zijn voordat de foto acquisitie.Zo zou een te stabiele cellijnen de uiting van de reporter-gen, die het mogelijk maken voor directe beeldvorming en leiden tot verminderde variatie te wijten aan het verminderde aantal processtappen te construeren. Op dit moment is het ontwerpen van een test die nauwkeurig en betrouwbaar toont kwantificeert een fenotype van belang is een belangrijk knelpunt in de HC screening proces.
Veel schermen zijn uitgevoerd in cellen van zoogdieren met behulp van verschillende RNAi bibliotheken, die allemaal lijden aan off-target effecten beperkt gene silencing efficiëntie en onvolledige genoom dekking. Zo bibliotheken moeten worden gemaakt die meer specifieke, krachtige en hebben een betere dekking. Er wordt gewerkt aan maken dergelijke Het is te hopen deze inspanningen zal de reproduceerbaarheid van de HT / HC scre te verbeteren en hits.
Een beperking van de vele grote schaal cell-based schermen zijn dat zij worden uitgevoerd in neuroblastoom cellen omdat ze kunnen genetisch worden gemanipuleerd en gekweekt om grote aantallen met relatief gemak. Echter, de relevantie van 'hits' die in ex vivo celcultuur modellen in vivo functie is twijfelachtig, vooral omdat de hersenen bestaan uit zeer gespecialiseerde celtypen die een dicht en ingewikkeld netwerk van synaptische verbindingen om te functioneren als een sterk geïntegreerde eenheid vormen. Als gevolg daarvan, is het gebruikelijk dat raakt geïdentificeerd met behulp van de screening methode zoals hierboven beschreven, worden gevalideerd in het tweede scherm het gebruik van extra technieken en in meer fysiologisch relevante modellen 39. Ter verbetering van de vertaling van hits die tijdens HCS, meer representatieve en geavanceerde modellen, zoals primaire cellen en gedifferentieerde stamcellen of co-cultuur systemen moeten worden ontwikkeld en aangepast voor HT / HC benaderingen.
ntent "> Met een combinatie van geautomatiseerde cel kweken en HC beeldvorming kan men snel nieuwe inzichten te krijgen in hoe neuronen functioneren en bepalen welke wegen belangrijk zijn voor ziekte-ontwikkeling. combinatie van HCS / HTS gegevens met informatie uit andere 'omics' nadert, zal het dan mogelijk zijn om een systeembiologische overzicht van hersenziekten te bouwen, waardoor het gemakkelijker therapeutische ontwikkeling.The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Hamilton programmeurs en specialisten voor de voortzetting van steun en Eva Blaas voor technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door twee NWO-Investeringssubsidies (911-07-031 en 40-00506-98-10011), Het Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 en de Neuroscience Campus Amsterdam, SJ wordt ondersteund door Ti-Pharma: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |