نحن تصف منهجية الجمع الآلي زراعة الخلايا على درجة عالية من المحتوى التصوير لتصور وتحديد العمليات الخلوية وهياكل متعددة ، بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تساعد في مثل هذه الأساليب الفنية الشرح مزيد من الجينوم فضلا عن تحديد شبكات الجينات المرض والمخدرات الأهداف المحتملة.
The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary ‘omics’ approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson’s Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long.
There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS.
HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a ‘phenomics’ scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility.
Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21.
Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.
مع تقلص تكاليف HT / HC أنظمة الفحص الخلوي ، جنبا إلى جنب مع توافر الأدوات الجينوم على نطاق وظيفة قوية لتعديل الجينات ، HT / HC شاشات أصبحت شائعة في الأوساط الأكاديمية. وقد تم بالفعل تطبيق هذا النهج بنجاح في مجالات متنوعة من الأبحاث ، مثل تحديد أهداف المخدرات في سرطان 9 ، 31-33 ، 34-36 التنمية الجنينية وحتى إمكانية لتطبيقها في فك المسارات المشاركة في الاضطرابات العصبية والنفسية 37،38. لكن تنفيذ مثل هذا النظام يتطلب استثمارا كبيرا من الوقت والجهد مع عملية التحسين وغالبا ما يأخذ ما لا يقل عن 6 أشهر. جميع الخطوات ، مثل trypsinization مرات ، وبسرعة وكثافة بذر pipetting يتعين تعديلها ، للتأكد من أن الخلايا السليمة وتنمو باستمرار. الوقاية من التلوث الجرثومي هي واحدة من أصعب التحديات التي تواجه الثقافة الآلي خلية الأسبوعية مع بروتوكولات التنظيف في جombination مع الشطف المستمر لجميع خطوط تحمل السائل مع الايثانول 70 ٪ كونها ضرورية للثقافات التلوث الحرة. وسوف يكون من الضروري أيضا تحسين الروبوتات بحيث الأدوات الإضافية ، مثل المجاهر مبائر لدقة أعلى ويمكن أن تكون متكاملة -80 درجة مئوية الثلاجات لتخزين المجمع.
وهناك أيضا القيود التي يتعين معالجتها من أجل تحسين حساسية ، وسرعة وفائدة هذه الطريقة لدراسة شبكات الجينات وتحديد الجينات المسؤولة عن المسارات الجزيئية المسببة للأمراض.
لإجراء الشاشة HT / منسق الشؤون الإنسانية وتحرص على جمع البيانات الموثوق بها ، وجوانب عدة لا بد من تحسينها. أولا ، الاعتماد على قياس أهمية قصوى ، ويعتمد على قوة وحساسية مقايسة. على سبيل المثال ، المقايسات المبينة أعلاه هي مناسبة لشاشات أصغر حجما ، ولكن من الصعب تنفيذها على نطاق واسع الجينوم ، ويرجع ذلك إلى تجهيز عدد الخطوات المطلوبة قبل الحصول على الصور.وهكذا ، فإن المرء لابد لبناء خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن الجينات المراسل ، التي من شأنها أن تسمح للتصوير المباشر ويؤدي إلى تباين انخفضت بسبب انخفاض عدد خطوات التجهيز. في الوقت الحاضر ، تصميم مقايسة أن يصور بدقة وبشكل موثوق الكمي النمط الظاهري للاهتمام هو عقبة رئيسية في عملية الفرز HC.
وتجرى العديد من الشاشات في خلايا الثدييات باستخدام مختلف المكتبات رني ، وكلها تعاني من آثار خارج الهدف ، ومحدودية الكفاءة إسكات الجينات وغير مكتملة تغطية الجينوم. وبالتالي الحاجة إلى المكتبات التي تكون أكثر تحديدا ، قوية ولها تغطية أفضل. هناك جهود جارية لإنشاء مثل هذه ومن المؤمل هذه المساعي من شأنها تحسين استنساخ HT / HC scre ان يضرب.
وجود قيود على العديد من الشاشات الكبيرة الحجم الخلية القائمة على أنها تجري في الخلايا العصبية لأنه لا يمكن التلاعب بها وراثيا وتربيتها لأعداد كبيرة مع السهولة النسبية. ومع ذلك ، فإن أهمية "يضرب" التي حددت في السابق من النماذج الحية لزراعة الخلايا في وظائف الجسم الحي هو مشكوك فيه ، خصوصا أن الدماغ يتكون من أنواع الخلايا المتخصصة جدا التي تشكل شبكة كثيفة ومعقدة من الاتصالات المشبكية لتعمل كوحدة متكاملة إلى حد كبير. نتيجة لذلك ، فمن الشائع أن يضرب تحديدها باستخدام نهج الفرز المبينة أعلاه ، يتم التحقق من صحة في الشاشات الثانوية باستخدام تقنيات إضافية وأكثر النماذج ذات الصلة في 39 الفسيولوجية. من أجل تحسين الترجمة من الزيارات التي تم تحديدها خلال HCS ، ونماذج أكثر تمثيلا وأكثر تطورا ، مثل الخلايا الأولية والخلايا الجذعية أو أنظمة متباينة المشترك ثقافة تحتاج إلى تطوير وتكييفها لHT / HC النهج.
ntent "> مع مزيج من زراعة الخلايا الآلي والتصوير HC أحد يستطيع كسب السريع رؤى جديدة في كيفية الخلايا العصبية وظيفة وتحديد المسارات التي تعتبر هامة لتطور المرض. الجمع بين HCS / HTS البيانات مع المعلومات الناتجة عن النهج الأخرى omics" ، فإنه سيتم عندئذ من الممكن لبناء نظرة عامة على نظم بيولوجيا أمراض الدماغ ، وبالتالي تسهيل التنمية العلاجية.The authors have nothing to disclose.
نشكر هاميلتون المبرمجين والمتخصصين لتقديم الدعم المستمر وBlaas إيفا للحصول على المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل اثنين من المنح للاستثمار NWO (911-07-031 و40-00506-98-10011) ، وبياتريس فون Prinses Wetenschapsprijs 2009 وحرم أمستردام العصبية ؛ معتمد من قبل TI – SJ فارما : T5 – 207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |