High Content Screening in Neurodegenerative Diseases
概要
Wir beschreiben eine Methode kombiniert automatisierte Zellkultur mit High-Content-Bildgebung zur Visualisierung und Quantifizierung von mehreren zellulären Prozessen und Strukturen, in einem High-Throughput Weise. Solche Methoden können in der weiteren funktionellen Annotation von Genomen Hilfe sowie zu identifizieren Krankheit Gen-Netzwerke und mögliche Angriffspunkte für Medikamente.
Abstract
Die funktionellen Annotation von Genomen, Aufbau von molekularen Netzwerken und neuartige Drug-Target-Identifizierung, sind wichtige Herausforderungen, die als eine Angelegenheit von großer Dringlichkeit 1-4 angegangen werden müssen. Mehrere komplementäre den Gebieten der "-Ansätze haben Hinweise auf die genetischen Risikofaktoren und pathogene Mechanismen zahlreicher neurodegenerativer Erkrankungen zur Verfügung gestellt, aber die meisten Ergebnisse noch erfordern eine funktionale Validierung 5. Zum Beispiel ist eine aktuelle genomweiten Assoziationsstudie für Parkinson (PD) identifizierten sich viele neue loci als Risikofaktoren für die Erkrankung, aber die zugrunde liegende ursächliche Variante (n) oder pathogenen Mechanismus nicht 6, 7 bekannt. Da jeder zugehörigen Bereich mehrere Gene enthalten können, wäre die funktionelle Bewertung der einzelnen Gene auf Phänotypen mit der Krankheit assoziiert, mit traditionellen zellbiologischen Techniken zu lange dauern.
Es gibt auch eine Notwendigkeit, die molekularen Netzwerke zu verstehen, die aufGenmutationen, die Phänotypen sie verursachen. Es wird erwartet, dass Krankheitsphänotypen das Ergebnis der vielfältigen Wechselwirkungen, die gestört haben. Wiederaufbau dieser Netzwerke mit traditionellen molekularen Methoden würden zeitaufwendig sein. Darüber hinaus werden Netzwerk-Vorhersagen aus unabhängigen Studien der einzelnen Komponenten, den Reduktionismus Ansatz, wahrscheinlich unterschätzen die Komplexität des Netzwerks 8. Diese Unterschätzung könnte zum Teil erklären die niedrige Erfolgsquote der Arzneimittelzulassung aufgrund von unerwünschten oder toxischen Nebenwirkungen. Der Erwerb von einem Netzwerk Perspektive der Krankheit verbundenen Wege mit HT / HC zelluläre Screening-Methoden, und Feststellung der wichtigsten Knoten innerhalb dieser Signalwege könnte zur Identifizierung von Zielen, die besser geeignet für eine therapeutische Intervention sind zu führen.
High-Throughput-Screening (HTS) ist eine ideale Methode, um diese Probleme 9-12 Adresse. aber die traditionellen Methoden wurden eindimensionale ganzen gut Zell-Assays, die Vereinfachung verwendetstic Anzeigen für komplexe biologische Prozesse. Sie waren nicht in der Lage, gleichzeitig zu quantifizieren viele Phänotypen bei neurodegenerativen Erkrankungen wie axonalen Transport Defizite oder Änderungen in der Morphologie Eigenschaften 13, 14 beobachtet. Dieser Ansatz konnte nicht verwendet werden, um die dynamische Natur der zellulären Prozessen oder pathogene Ereignisse, die in einer Untergruppe von Zellen auftreten zu untersuchen. Zur Quantifizierung solcher Merkmale muss man, um multi-dimensionale Phänotypen bewegen bezeichnet High-Content Screening (HCS) 4, 15-17. HCS ist die zell-basierte Quantifizierung von mehreren Prozessen gleichzeitig, das eine detailliertere Darstellung der zellulären Antwort auf verschiedene Störungen bietet im Vergleich zu HTS.
HCS hat viele Vorteile gegenüber HTS 18, 19, aber die Durchführung einer Hochdurchsatz-(HT)-High-Content-(HC)-Bildschirm in neuronalen Modellen ist problematisch wegen der hohen Kosten, ökologische Vielfalt und menschliche Fehler. Um zelluläre Reaktionen auf eine "phenomics 'scale erkennenmit HC Bildgebung muss man Variation und Fehler zu reduzieren, bei gleichzeitiger Erhöhung der Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit.
Hier beschreiben wir eine Methode, um präzise und zuverlässig durchzuführen shRNA Bildschirme mit automatisierten Zellkultur 20 und HC Imaging in neuronalen Zellen Modellen. Wir beschreiben, wie wir diese Methode verwendet, um Modulatoren für ein bestimmtes Protein, DJ1, die, wenn mutiert Ursachen autosomal rezessiv Parkinsonismus 21 identifizieren.
Die Kombination der Vielseitigkeit der HC-Bildgebung mit HT-Methoden ist es möglich, genau zu quantifizieren eine Vielzahl von Phänotypen. Dies könnte dann genutzt werden, um unser Verständnis des Genoms, die Wege in der Krankheitsentstehung beteiligt sind vorab zu identifizieren sowie potentielle therapeutische Targets werden.
Protocol
Discussion
Mit der sinkenden Kosten für HT / HC zelluläre Screening-Systeme, mit der Verfügbarkeit von leistungsfähigen genomweiten Werkzeuge, um Genfunktionen verändern kombiniert werden HT / HC-Bildschirme zum Alltag in der Wissenschaft. Der Ansatz wurde bereits erfolgreich auf den verschiedensten Bereichen der Forschung wie die Identifizierung von Drug Targets in der Krebstherapie 9, 31-33 und 34-36 der Embryonalentwicklung angelegt und hat sogar das Potenzial für den Einsatz in der Entschlüsselung der Signalwege in neuropsychiatrischen Störungen 37,38 beteiligt. Doch die Umsetzung eines solchen Systems erfordert einen erheblichen Aufwand an Zeit und Aufwand bei der Prozessoptimierung oft unter ein Minimum von 6 Monaten. Alle Schritte, wie Trypsinierung Zeiten, Pipettieren Geschwindigkeiten und Aussaatdichten müssen angepasst werden, um sicherzustellen, dass die Zellen gesund sind und wachsen ständig. Prävention von bakterieller Kontamination ist eine der schwierigsten Herausforderungen für automatisierte Zellkultur mit wöchentlicher Reinigung Protokolle in combination mit konstanter Spülung aller Gleitlagerröhre Linien mit 70% Ethanol, die für frei von Verunreinigungen Kulturen. Es wird auch notwendig sein, die Robotik zu verbessern, so dass zusätzliche Instrumente, wie die konfokale Mikroskope für eine höhere Auflösung und -80 ° C Tiefkühltruhen für Compound Storage integriert werden kann.
Es gibt auch Einschränkungen, die angegangen, um die empfindlichen, Geschwindigkeit und Nutzen dieser Methode, um Gen-Netzwerke zu studieren und zu identifizieren Gene in pathogenen molekularen Mechanismen beteiligt zu verbessern werden müssen.
Zur Durchführung einer HT / HC-Bildschirm und sicherstellen, dass zuverlässige Daten erhoben werden, haben verschiedene Aspekte optimiert werden. Erstens ist die Zuverlässigkeit der Messung entscheidend und ist abhängig von der Robustheit und Empfindlichkeit des Tests. Zum Beispiel sind die oben beschriebenen Assays geeignet für kleinere Bildschirme, sind aber schwierig, auf einer genomweiten Maßstab, aufgrund der Anzahl Verarbeitungsschritte vor der Bildaufnahme erforderlich sind, umzusetzen.So müsste man, um stabile Zelllinien, die Reporter-Gen, das für die direkte Bildgebung erlauben würde und zu einer verminderten Variation aufgrund der reduzierten Anzahl von Bearbeitungsschritten zu konstruieren. Derzeit Gestaltung eines Assays, die genau zeigt und zuverlässig quantifiziert einem Phänotyp von Interesse ist ein großer Engpass bei der HC Screening-Prozess.
Viele Bildschirme sind in Säugetierzellen mit unterschiedlichen RNAi-Bibliotheken, die alle aus dem Off-Target-Effekte, begrenzt Gen-Silencing Effizienz und unvollständiger Genomabdeckung leiden durchgeführt. So Bibliotheken müssen gemacht, die sind spezifischer, potenter und haben eine bessere Abdeckung werden. Die Bemühungen sind im Gange, um zu schaffen, wie Es ist zu hoffen, solche Bemühungen wird die Reproduzierbarkeit der HT / HC Eindrehen verbessern en Treffer.
Eine Einschränkung der viele großformatige Zelle based screens sind, dass sie in Neuroblastom-Zellen durchgeführt werden, weil sie genetisch manipuliert werden kann und kultiviert, um eine große Anzahl mit relativer Leichtigkeit. Allerdings ist die Relevanz der "Besucher" in ex vivo Zellkultur-Modellen zu identifizieren in vivo-Funktion fragwürdig, zumal das Gehirn von hoch spezialisierten Zelltypen, die ein dichtes und kompliziertes Netzwerk von synaptischen Verbindungen zu funktionieren, wie eine hoch integrierte Einheit bilden besteht. Als Folge ist es üblich, dass Zugriffe, die anhand des Screening-Ansatzes oben beschrieben, sind in Sekundär-Bildschirme mit zusätzlichen Techniken und in mehr physiologisch relevanten Modelle 39 validiert. Zur Verbesserung der Übersetzung Zugriffe während HCS identifiziert, müssen repräsentativer und komplexer Modelle, wie zB primären Zellen und differenzierten Stammzellen oder Co-Kultur-Systemen entwickelt und angepasst für HT / HC Ansätze.
ntent "> Mit einer Kombination aus automatisierten Zellkultur-und HC-Bildgebung kann man schnell gewinnen neue Einblicke, wie Neuronen funktionieren und welche Wege sind wichtig, um die Entwicklung der Krankheit. Kombinieren HCS / HTS-Daten mit Informationen aus anderen" Gebieten der "Ansätze generiert, wird es dann möglich sein, eine Systembiologie Überblick über Erkrankungen des Gehirns zu konstruieren, und erleichtert so therapeutischen Entwicklung.開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Hamilton-Programmierer und Spezialisten für anhaltende Unterstützung und Eva Blaas für die technische Unterstützung. T5-207: SJ wird durch Ti-Pharma unterstützt; Diese Arbeit wurde von zwei NWO Investitionszuschüsse (911-07-031 und 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 und der Neuroscience Campus Amsterdam unterstützt.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number |
| AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
| OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
| RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
| OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
| 96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
| DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
| BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
| MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
| HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
| HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
| TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
| DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
| PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
| SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
| CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |
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