הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.
Abstract
תאי גזע האדם בעלי עוצמה מציעים מערכת חזקה כדי לחקור את תפקוד הגנים ואת המודל מוטציות ספציפיות הרלוונטיות למחלה. הדור של שינויים גנטיים heterozygous מדויק מאתגר בשל CRISPR-CAS9 מתווך indel היווצרות ב allele השני. כאן, אנו להדגים פרוטוקול כדי לסייע להתגבר על הקושי הזה באמצעות שתי תבניות תיקון שבו רק אחד מבטא את שינוי הרצף הרצוי, בעוד שתי התבניות מכילות מוטציות שקטות כדי למנוע גזירה מחדש ומבנה indel. מתודולוגיה זו היא היתרון היעיל ביותר עבור הקוד לעריכת גנים באזורים של DNA כדי ליצור שליטה איזוגניים וקווי גזע האדם האנושי ללמוד מחלות אנושיות וביולוגיה. בנוסף, אופטימיזציה של העברת החצייה ומתודולוגיות ההקרנה בוצעו כדי להפחית את העבודה והעלות של ניסוי בעריכת גנים. בסך הכל, הפרוטוקול הזה הוא ישים נרחב לעריכת הגנום רבים באמצעות המודל האנושי pluriפוטנטי.
Introduction
האדם תאים גזע עובריים (hESCs) והמושרה תאים גזע pluriפוטנטי (iPSCs) הם כלים יקרי ערך למידול מחלות האדם בשל יכולתם להתחדשות, תוך שמירה על היכולת ליצור סוגי תאים של שונות לושלות1,2 ,3,4. מודלים אלה לפתוח את האפשרות לחקור פונקציה גנטית, ולהבין כיצד מוטציות ספציפיות פנוטיפים קשורים מחלות שונות5,6. עם זאת, כדי להבין כיצד שינוי מסוים מקושר לפנוטיפ מסוים, שימוש בפקד איזוגניים משויך ובקווי תא של מוטציה חשוב לשלוט בשורה לשונות שורה7,8. תמלול activator כמו נוקלאוסיס (TALENs) והנוקלאוסים אצבע אבץ שימשו כדי ליצור הוספה או מחיקה (indels) מוטציות במודלים גנטיים מגוונים, כולל תאים ראשוניים; אבל הנוקלאוסים האלה יכולים להיות מסורבל לשימוש ויקר9,10,11,12,13,14. הגילוי של באשכולות באופן קבוע הכולל מרווחים לחזור קצר palindromic (crispr)-CAS9 נוקלאז יש מהפכה בשדה בשל יעילות היווצרות indel כמעט בכל אזור של הגנום, פשטות השימוש, וצמצום עלות15 , מיכל בן 16 , מיכל בן 17 , מיכל בן 18 , . בן 19
אתגר בשימוש crispr-CAS9 מבוסס הגנום לעריכת הטכנולוגיה כבר הדור או תיקון של מוטציות ספציפיות אלל אחד בלי ליצור מוטציה indel ב אלל השני20. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להתגבר על האתגר הזה על ידי שימוש בשני משתמשים בעלי התקן בודד ומבודד (ssODN) תיקון תבניות כדי להפחית את היווצרות indel ב allele השני. שני ssODNs נועדו להכיל מוטציות שתיקה כדי למנוע חיתוך מחדש על ידי CAS9 nuclease, אבל רק אחד מכיל שינוי של עניין. שיטה זו מגבירה את היעילות של יצירת שינוי גנטי מסוים heterozygous מבלי לגרימת היווצרות indel ב allele השני. באמצעות פרוטוקול זה, הניסויים בעריכת גנים בשישה מיקומים גנומית עצמאית להפגין את המבוא המדויק של שינוי גנומית הרצוי באחד אלל ללא היווצרות indel ב אלל השני ומתרחשת עם יעילות כוללת של ~ 10%. הפרוטוקול המתואר הותאם מ מגווייר ואח ‘21.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, את השימוש CRISPR-CAS9 יחד עם שני ssODN לתקן תבניות כדי לייצר heterozygous מסוימים או שינויים הגנום homozygous מוצג בתאי גזע האדם pluriפוטנטי. שיטה זו הביאה את הדור המצליח של קווי התא isogenic המבטא heterozygous גנומית שינויים עם יעילות קרוב ל 10%. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה עבור ESCs האנושית ו iPSCs גדל על MEFs הקר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מימון של הלב הלאומי, הריאות, ובדם המכון (NHLBI), המכונים הלאומיים לבריאות באמצעות מענקים U01HL099656 (מ. פ. D.L.F.) ו U01HL134696 (למעלה ו D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
