Este protocolo presenta un nuevo sistema de genes reporteros y la configuración experimental para detectar la transcripción en roturas de doble cadena de ADN con sensibilidad de molécula única.
Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son el tipo más grave de daño en el ADN. A pesar de las consecuencias catastróficas en la integridad del genoma, sigue siendo hasta ahora difícil de alcanzar cómo los DSB afectan la transcripción. Una razón para esto fue la falta de herramientas adecuadas para monitorear simultáneamente la transcripción y la inducción de un DSB génico con suficiente resolución temporal y espacial. Este trabajo describe un conjunto de nuevos reporteros que visualizan directamente la transcripción en células vivas inmediatamente después de la inducción de un DSB en la plantilla de ADN. Los bucles de tallo de ARN de bacteriófagos se emplean para monitorear la transcripción con sensibilidad de una sola molécula. Para dirigir el DSB a una región genética específica, los genes reporteros están diseñados para contener una sola secuencia de reconocimiento de la endonucleasa homing I-SceI, de lo contrario ausente del genoma humano. Una sola copia de cada gen reportero se integró en el genoma de las líneas celulares humanas. Este sistema experimental permite la detección de moléculas individuales de ARN generadas por la transcripción de genes canónicos o por la iniciación de la transcripción inducida por rotura de ADN. Estos reporteros brindan una oportunidad sin precedentes para interpretar las interacciones recíprocas entre la transcripción y el daño al ADN y para revelar aspectos hasta ahora no apreciados de la transcripción inducida por la ruptura del ADN.
Las roturas de doble cadena de ADN (DSB) son lesiones tóxicas del ADN que alteran la función celular y contribuyen a la insurgencia de varias enfermedades y al envejecimiento1. Las mutaciones resultantes de la reparación inexacta de los DSB afectan la expresión génica y establecen las bases para el declive funcional de la célula. La visión emergente de que los DSB impulsan la transcripción inducida por ruptura de novo en el sitio de la lesión2,3,4,5,6,7 sugiere que los DSB también pueden afectar la función celular a través de ARN inducidos por rotura. Varios estudios recientes indican que los DSB son suficientes para iniciar la transcripción programada (por ejemplo, en genes inducibles por estímulos) y no programada (por ejemplo, en promotores no canónicos)4,5,7. Sin embargo, a pesar de varios estudios que exploran los vínculos entre el daño del ADN y la transcripción, el campo todavía se retrasó en su capacidad para ofrecer una caracterización precisa (es decir, de una sola molécula) de los eventos transcripcionales en los sitios de ruptura del ADN. Una razón importante para esto fue la falta de herramientas experimentales apropiadas. La irradiación celular (rayos γ, rayos X, iones pesados) y los tratamientos farmacológicos (por ejemplo, inhibidores de la topoisomerasa o agentes intercalantes) carecen de precisión espacial e inducen lesiones de ADN distintas de los DSB, incluidas las roturas de una sola cadena y los aductos de ADN8. Las endonucleasas, como I-PpoI y AsiSI, generan DSB específicos de locus, pero no se han combinado con un sistema que permita la visualización simultánea de la transcripción en células vivas en un solo locus con alta precisión temporal8. Para evitar esta limitación, nuestro laboratorio encabezó el desarrollo de un conjunto de reporteros de vanguardia que visualizan directamente la transcripción con resolución de una sola molécula tras la inducción controlada de un DSB4 único. Aquí, describimos a estos reporteros, proporcionamos un protocolo detallado para imágenes de células vivas de la transcripción en DSB y mostramos datos que revelan el inicio de la transcripción en un solo DSB.
Los sistemas de genes reporteros utilizados en este protocolo se basan en el bien caracterizado gen reportero IgM de ratón y contienen los exones M1 y M2 de la forma unida a la membrana (μm) de la cadena pesada IgM μ 9,10,11. Un intrón híbrido separa los dos exones con el fuerte adenovirus de transcripción tardía mayor (AdML) py tract12. La expresión de los genes reporteros está controlada por el promotor del citomegalovirus humano (CMV), en el que se han insertado dos copias en tándem de la secuencia del operador de Tet (TetO). Los genes reporteros se insertan en un vector plásmido que contiene un sitio Flp Recombination Target (FRT) y se insertan en un sitio objetivo ESPECÍFICO de FRT en el genoma de una línea celular huésped HEK293. Esta línea celular también expresa constitutivamente la proteína represora Tet para regular la expresión del gen reportero a través de la presencia o ausencia de tetraciclina/doxiciclina. Para permitir la visualización de la transcripción del gen reportero, se insertaron 24 repeticiones en tándem de la secuencia del bucle del tallo MS2 y 24 repeticiones en tándem de la secuencia del bucle del tallo PP7 en diferentes posiciones con respecto al sitio de inicio de la transcripción y la estructura del exón/intrón del gen reportero. Los bucles del tallo de ARN MS2/PP7 se forman tras la transcripción y se unen específicamente a proteínas de la capa MS2/PP7 expresadas ectópicamente marcadas con proteínas fluorescentes verdes y rojas, una estrategia ampliamente utilizada antes para la transcripción de imágenes13,14,15. Además, se insertó una sola copia de la secuencia de reconocimiento de 18 pb para la endonucleasa homing I-SceI que está flanqueada directamente por las matrices de secuencia de arn stem-loop en los genes reporteros. Se utilizaron técnicas de clonación estándar para generar todos los plásmidos, el fragmento que contiene el bucle de tallo I-SceI-24xMS2 del gen reportero PROP fue sintetizado por un servicio comercial de síntesis de genes.
El gen promotor-proximal DSB reporter (PROP) se construyó insertando el sitio de corte I-SceI 45 pares de bases (pb) aguas abajo del supuesto sitio de inicio de la transcripción en el exón I, seguido de 149 pb hasta el inicio del cassette 24x MS2 stem-loop, que fue diseñado de novo con dos secuencias alternas no idénticas stem-loop16 y cinco secuencias de espaciadores no repetitivas de 20 pb para reducir la redundancia. La matriz de bucle de vástago MS2 es seguida por 72 pb hasta el comienzo del intrón de 1844 pb y el exón II de 1085 pb hasta el sitio de escisión y poliadenilación. El exón II codifica una proteína fluorescente cian (CFP) fusionada a una secuencia de orientación peroxisomal C-terminal (PTS) de la acil CoA oxidasa peroxisomal humana para permitir un cribado independiente de la expresión génica del reportero (Figura 1A).
El gen reportero DSB exon II (EX2) consiste en un exón I de 167 pb seguido del intrón y el exón II que codifica el CFP-PTS. Más abajo, a una distancia de 169 pb, se insertó un casete que contenía 24 bucles de vástago MS2, seguido de una secuencia de enlazador de 84 pb con un sitio I-SceI en el centro, seguido de 24 bucles de vástago PP7 y 221 pb hasta el sitio de escisión y poliadenilación17 (Figura 1B).
Por último, el gen reportero DSB exon II con etiquetado de transcripción antisentido (EX2AS) se basa en la transcripción del gen de la ubiquitina B humana (UBB) UBB-201 y contiene dos exones y un intrón. El exón I tiene una longitud total de 1534 pb con una inserción inversa de la secuencia de bucle de tallo MS2 24x. Por lo tanto, la secuencia correcta de ARN del bucle del tallo MS2 se transcribirá en una dirección antisentido con respecto a la transcripción sensorial del gen reportero del promotor del CMV. El intrón tiene una longitud de 490 pb, seguido del exón II con el sitio I-SceI , y se insertó una región codificante para dos subunidades de ubiquitina en el marco. Aguas abajo del gen UBB hay una secuencia que forma un bucle de tallo PP7 24x tras la transcripción del gen reportero en una dirección sensorial (Figura 1C).
La transfección transitoria de un constructo inducible de la endonucleasa I-SceI permite la creación controlada de un DSB en el sitio de reconocimiento insertado dentro de cada gen reportero18. La endonucleasa I-SceI se fusiona en marco con el dominio de unión al ligando del receptor glucocorticoide y una proteína fluorescente de color rojo lejano iRFP713. Este constructo es citoplasmático en ausencia de acetónido de triamcinolona (TA), pero migra rápidamente al núcleo tras la adición de TA al medio de crecimiento de las células (Figura 1D). La inducción de DSB por el sistema I-SceI es robusta, como se demostró antes18,19,20. La transcripción del gen reportero se puede monitorear en paralelo visualizando los sistemas de asa madre de ARN marcados fluorescentemente MS2 y PP7.
Los conflictos entre procesos biológicos esenciales como la replicación, la transcripción, el daño al ADN y la reparación del ADN se han identificado como una fuente crítica de inestabilidad del genoma22. Estos estudios también han llevado al descubrimiento de la transcripción en sitios de daño en el ADN y han atribuido un papel funcional a las transcripciones inducidas por rotura en la regulación de los procesos de reparación del daño del ADN23. Las nuevas herramientas y el protocolo descrito aquí permiten una mayor investigación de la dinámica de transcripción del ARN Pol II en los DSB. Un punto crítico en este protocolo es la generación de líneas celulares que contienen una sola copia del gen reportero integrado en el genoma. Esta característica clave elimina el ruido creado por la transcripción de varios genes reporteros integrados con múltiples copias dentro de un solo locus genómico y permite la recopilación de parámetros cinéticos de la dinámica de transcripción y transcripciones individuales de ARN. Un requisito técnico crucial para observar la transcripción de integraciones de genes de un solo reportero es la disponibilidad de un sistema de microscopio que permita la detección de transcripciones de ARN único marcadas con el sistema MS2 o PP7 en células vivas4,12. Aquí, la microscopía de células vivas se realiza en un sistema de disco giratorio confocal montado en un microscopio invertido, equipado con láseres de estado sólido de 100 mW acoplados a un filtro sintonizable acústico-óptico como se describe en otra parte24. Además, para estudiar la transcripción en un solo DSB utilizando los reporteros, las células individuales deben ser monitoreadas cuidadosamente para lograr la resolución de tiempo más alta, lo que requiere células de imágenes durante varias horas, lo que lo convierte en un ensayo de bajo rendimiento. Aún así, observamos varias células en paralelo con el posicionamiento controlado por una etapa de microscopio piezoaccionado. Para garantizar condiciones ambientales óptimas para la observación de células vivas durante horas, el cuerpo del microscopio, incluida la etapa de muestra, se coloca dentro de una cámara ambiental de plexiglás. Además, se monta una cámara de incubación de etapa cerrada en la etapa del microscopio y se conecta a los controladores de suministro de CO2 y humedad.
El primer paso crítico en el protocolo es la selección de regiones de interés con células para la obtención de imágenes. Cada posición XY marcada para la obtención de imágenes debe contener una o más células que muestren transfección con las proteínas de unión al asa madre de ARN fluorescente de acuerdo con el gen reportero y el esquema de transfección descritos en la Sección 1, Tabla 1, así como en la Figura 2D, E. Además, las células deben exhibir sitios de transcripción marcados brillantes que deben ser co-transfectados con la construcción I-SceI-GR-iRFP713, y la proteína debe localizarse inicialmente en el citoplasma (Figura 2D y E).
Las células deben mostrar un nivel de intensidad de fluorescencia de la proteína de la capa MS2 y/o PP7 marcada fluorescentemente no unida lo suficientemente baja como para detectar transcripciones de una sola etiqueta sobre el nivel de fluorescencia de fondo. Al mismo tiempo, es necesario un nivel robusto de intensidad de fluorescencia de las proteínas de la capa MS2 y / o PP7 marcadas fluorescentemente para permitir la obtención de imágenes durante al menos 60 minutos sin perder demasiada fluorescencia debido a algún blanqueamiento que se produce. La “Visualización de imagen de escala” con un rango fijo como se describe en la Sección 3.7 se utiliza para permitir una selección estandarizada de células de acuerdo con su nivel de intensidad de fluorescencia.
Un segundo paso crítico del protocolo es agregar el TA a las celdas en posiciones XY predeterminadas a través del pequeño orificio en la tapa del plato con fondo de vidrio. Cualquier manipulación del plato de fondo de vidrio causaría un cambio de la posición XY marcada de las células y debe evitarse. Por lo tanto, el manejo cuidadoso de la micropipeta mientras se agrega la TA diluida en el medio de crecimiento celular es vital para la observación exitosa de las células preseleccionadas, como se demuestra en la Figura 2F. La adaptación de diferentes sistemas para agregar medicamentos a células montadas en una etapa de microscopio, como un sistema de perfusión, requeriría una cámara de incubación de etapa separada con aberturas de entrada y salida de tubos y una bomba o sistema de inyección para administrar medicamentos. Otros métodos, como las diapositivas de canal con superficies inferiores similares a un deslizamiento de cubierta, dan como resultado una difusión lenta de los medicamentos administrados en el canal y causan un retraso adicional entre la adición del medicamento y el efecto. Finalmente, el pipeteo imprudente en una abertura de deslizamiento de canal también puede cambiar la posición de la muestra. Por lo tanto, el sistema actual con un orificio perforado personalizado en la tapa de un plato con fondo de vidrio es fácil de adaptar, de bajo costo y adecuado para administrar diferentes medios de crecimiento, medicamentos y componentes. El pequeño diámetro del orificio y la atmósfera humidificada en la cámara de incubación de la etapa también evitan el secado del medio celular.
Un tercer paso crítico en este protocolo es el análisis de datos, que requiere una inspección manual de los puntos de tiempo en que cesa la transcripción debido a la inducción de un DSB. El punto de tiempo de terminación de la transcripción se indica liberando las últimas transcripciones del sitio previamente brillante de la transcripción del gen reportero. Del mismo modo, los eventos de iniciación de la transcripción inducida por ruptura deben inspeccionarse con cuidado para detectar eventos de transcripción individuales con la relación señal-ruido relativamente baja de los ARNm únicos marcados con fluorescencia.
La dinámica de reparación del OSD inducido añade una capa adicional de complejidad a los análisis de los datos generados utilizando estos informadores, limitándolos a los primeros minutos inmediatamente después de la inducción del OSD. La naturaleza transgénica de los genes reporteros y la naturaleza rica en repeticiones de las matrices de bucle de tallo MS2 y PP7 pueden ensamblar un paisaje único de cromatina, interfiriendo con el establecimiento de supuestos programas de transcripción estables inducidos por ruptura. No obstante, en comparación con la irradiación ionizante o UV, la inducción mediada por I-SceI de un DSB en genes reporteros es un sistema mucho más robusto para investigar la transcripción en DSB individuales.
Diferentes sistemas de endonucleasa como I-CreI, I-PpoI o AsiSI que tienen o no sitios de reconocimiento adicionales dentro del genoma humano se pueden combinar con los actuales sistemas de genes reporteros para una posible mayor eficiencia de generación de DSB. Sin embargo, primero requieren introducir el sitio de reconocimiento de endonucleasa en los genes reporteros. En segundo lugar, pueden tener una variabilidad similar en el momento y la eficiencia de la inducción de un DSB en células individuales. Por otro lado, la inserción de copias en tándem de los sitios de reconocimiento de endonucleasa puede aumentar la eficiencia de la inducción de DSB. Además, probar los sistemas de genes reporteros presentados en diferentes líneas celulares permitiría la comparación de la dinámica de transcripción en los sitios DSB entre diferentes fondos celulares y la disponibilidad de diferentes vías de reparación del daño del ADN, como en células cancerosas, células primarias y células diferenciadas no ciclantes. Sin embargo, la construcción de los genes reporteros para que sean compatibles con el sistema Flp/FRT está limitando actualmente la integración en las líneas celulares huésped Flp/FRT disponibles.
Además de las aplicaciones basadas en microscopía, los genes reporteros actuales también pueden combinarse con ensayos bioquímicos, como la inmunoprecipitación de cromatina, para estudiar el reclutamiento de factores de reparación o transcripción del ADN en un solo DSB o para evaluar la ocupación de nucleosomas, las modificaciones de histonas y el estado de cromatina alrededor del sitio de DSB. Además, una combinación con diferentes sistemas de reporteros permitiría el estudio de los vínculos funcionales entre el daño del ADN y procesos como la organización del genoma o la replicación del ADN.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca por los regalos de plásmidos y reactivos. También estamos en deuda con el personal de iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento y J. Rino, por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 y PTDC/MED-OUT/4301/2020 de la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal y por LISBOA-01-0145-FEDER-007391, proyecto cofinanciado por FEDER a través de POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa y FCT. También se recibió financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la UE (RiboMed 857119). M.A. es el destinatario de la beca FCT Ph.D. 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |