Este protocolo apresenta um novo sistema genético repórter e a configuração experimental para detectar transcrição em quebras de dupla cadeia de DNA com sensibilidade de molécula única.
As quebras de dois fios de DNA (DSB) são o tipo mais grave de dano de DNA. Apesar das consequências catastróficas sobre a integridade do genoma, permanece até agora evasivo como os DSBs afetam a transcrição. Uma razão para isso foi a falta de ferramentas adequadas para monitorar simultaneamente a transcrição e a indução de um DSB gênico com resolução temporal e espacial suficiente. Este trabalho descreve um conjunto de novos repórteres que visualizam diretamente a transcrição em células vivas imediatamente após a indução de um DSB no modelo de DNA. Os loops-tronco bacteriophage RNA são empregados para monitorar a transcrição com sensibilidade de molécula única. Para direcionar o DSB para uma região genética específica, os genes repórteres são projetados para conter uma única sequência de reconhecimento do endonuclease I-SceI homing, caso contrário ausente do genoma humano. Uma única cópia de cada gene repórter foi integrada ao genoma das linhas celulares humanas. Este sistema experimental permite a detecção de moléculas de RNA únicas geradas pela transcrição genética canônica ou pela iniciação de transcrição induzida por dna. Esses repórteres oferecem uma oportunidade sem precedentes para interpretar as interações recíprocas entre transcrição e dano de DNA e divulgar aspectos até então não apreciados da transcrição induzida por quebra de DNA.
As quebras de dupla-vertente de DNA (DSBs) são lesões tóxicas de DNA que interrompem a função celular e contribuem para a insurgência de várias doenças e envelhecimento1. Mutações resultantes do reparo impreciso dos DSBs impactam a expressão genética e definem a base para o declínio funcional da célula. A visão emergente de que os DSBs conduzem de nova transcrição induzida por arrombamento no local da lesão2,3,4,5,6,7 sugere que os DSBs também podem afetar a função celular através de RNAs induzidas por ruptura. Vários estudos recentes indicam que os DSBs são suficientes para iniciar transcrição programada (por exemplo, em genes indutíveis por estímulo) e não programada (por exemplo, em promotores não canônicos) transcrição4,5,7. No entanto, apesar de vários estudos explorando as ligações entre danos no DNA e transcrição, o campo ainda defasado em sua capacidade de entregar uma caracterização precisa (ou seja, única molécula) dos eventos transcricionais em locais de quebra de DNA. Uma razão importante para isso foi a falta de ferramentas experimentais adequadas. A irradiação celular (γ-raios, raios-X, íons pesados) e tratamentos medicamentosos (por exemplo, inibidores de topoisomerase ou agentes intercalantes) carecem de precisão espacial e induzem lesões de DNA além de DSBs, incluindo quebras de fios únicos e adutos de DNA8. Endonucleases, como I-PpoI e AsiSI, geram DSBs específicos do lócus, mas não foram combinados com um sistema que permite visualização simultânea de células vivas de transcrição em um único lócus com alta precisão temporal8. Para contornar essa limitação, nosso laboratório liderou o desenvolvimento de um conjunto de repórteres de ponta que visualizam diretamente a transcrição com resolução de molécula única após a indução controlada de um DSB4 único. Aqui, descrevemos esses repórteres, fornecemos um protocolo detalhado para imagens de células ao vivo de transcrição em DSBs e mostramos dados revelando iniciação de transcrição em um único DSB.
Os sistemas genéticos repórteres usados neste protocolo são baseados no bem caracterizado gene repórter IgM do mouse e contêm os exons M1 e M2 da forma ligada à membrana (μm) do IgM μ cadeia pesada9,10,11. Um intron híbrido separa os dois exons com o forte adenovírus grande transcrição tardia (AdML) PY tract12. A expressão dos genes repórteres é controlada pelo promotor de citomegalovírus humano (CMV), no qual duas cópias tandem da sequência do operador Tet (TetO) foram inseridas. Os genes do repórter são inseridos em um vetor plasmídeo contendo um local de Alvo de Recombinação de Flp (FRT) e inseridos em um local específico de destino FRT no genoma de uma linha de células hospedeiras HEK293. Esta linha celular também expressa constitutivamente a proteína repressora Tet para regular a expressão do gene repórter através da presença ou ausência de tetraciclina/doxiciclina. Para permitir a visualização da transcrição do gene repórter, 24 repetições tandem da sequência do loop de haste MS2 e 24 repetições tandem da sequência de loop de haste PP7 foram inseridas em diferentes posições em relação ao local de início da transcrição e estrutura exon/intron do gene repórter. Os loops de haste MS2/PP7 se formam após a transcrição e são especificamente vinculados por proteínas de casaco MS2/PP7 expressas em êxtase marcadas com proteínas fluorescentes verdes e vermelhas, uma estratégia amplamente utilizada antes para transcrição de imagem13,14,15. Além disso, uma única cópia da sequência de reconhecimento de 18 bps foi inserida para o endonuclease i-SceI homing que é diretamente ladeado pelas matrizes de sequência de loop-tronco RNA nos genes do repórter. Técnicas padrão de clonagem foram usadas para gerar todos os plasmídeos, o fragmento contendo o loop-tronco I-SceI-24xMS2 do gene prop reporter foi sintetizado por um serviço de sintetização de genes comerciais.
O gene de repórter DSB (PROP) promotor-proximal foi construído inserindo o site de corte I-SceI 45 pares de base (bp) a jusante do local inicial de transcrição putativa em exon I, seguido por 149 bp até o início do de loop de haste 24x MS2, que foi projetado de novo com duas sequências alternadas não idênticas de tronco-loop16 e cinco sequências espaciais não repetitivas de 20 bp para reduzir a redundância. A matriz de loop-tronco MS2 é seguida por 72 bp até o início do intron de 1844 bp e o exon II de 1085 bp até o local de decote e poliadenilização. O exon II codifica uma proteína fluorescente ciano (CFP) fundida a uma sequência de alvo peroxisomal terminal C (PTS) do acicl humano Acyl CoA oxidase para permitir uma triagem independente da expressão genética repórter (Figura 1A).
O gene repórter exon II DSB (EX2) consiste em um exon de 167 bp I seguido pelo intron e exon II codificando o CFP-PTS. Mais a jusante a uma distância de 169 bp, um contendo alças-tronco MS2 24x foi inserido, seguido por uma sequência de linker de 84 bp com um site I-SceI no centro, seguido por alças-tronco 24x PP7 e 221 bp até o local de decote e poliadenilização17 (Figura 1B).
Por fim, o gene repórter exon II DSB com rotulagem de transcrição antissense (EX2AS) é baseado na transcrição genética ubiquitina humana UBB-201 e contém dois exons e um intron. O exon I tem um comprimento total de 1534 bp com uma inserção inversa da sequência de loop-tronco MS2 24x. Portanto, a sequência de RNA de loop-tronco MS2 correta será transcrita em uma direção antissamerada no que diz respeito à transcrição do sentido do gene repórter do promotor do CMV. O intron tem um comprimento de 490 bp, seguido por exon II com o site I-SceI , e uma região de codificação foi inserida para duas subunidades de ubiquitina no quadro. A jusante do gene UBB é uma sequência que forma um loop de haste 24x PP7 após a transcrição do gene repórter em uma direção de sentido (Figura 1C).
A transfecção transitória de uma construção indutível do endonuclease homing I-SceI permite a criação controlada de um DSB no local de reconhecimento inserido dentro de cada gene repórter18. A endonuclease I-SceI é fundida em quadro com o domínio de ligação de ligantes do receptor glicocorticoide e uma proteína fluorescente vermelha e iRFP713. Esta construção é citoplasmática na ausência de acetonida triamcinolone (TA), mas migra rapidamente para o núcleo após a adição de TA ao meio de crescimento das células (Figura 1D). A indução de DSBs pelo sistema I-SceI é robusta, como demonstrado antes de 18,19,20. A transcrição genética do repórter pode ser monitorada em paralelo visualizando os sistemas de loop-tronco RNA fluorescentemente marcados MS2 e PP7.
Conflitos entre processos biológicos essenciais como replicação, transcrição, dano de DNA e reparação de DNA foram identificados como uma fonte crítica de instabilidade do genoma22. Esses estudos também levaram à descoberta da transcrição em locais de danos no DNA e atribuíram um papel funcional às transcrições induzidas por invasões na regulação dos processos de reparação de danos de DNA23. As novas ferramentas e o protocolo aqui descrito permitem uma investigação mais aprofundada da dinâmica de transcrição do RNA Pol II nos DSBs. Um ponto crítico neste protocolo é a geração de linhas celulares que contêm uma única cópia do gene repórter integrado ao genoma. Este recurso-chave elimina o ruído criado pela transcrição de vários genes de repórteres integrados com múltiplas cópias dentro de um único lócus genômico e permite a coleta de parâmetros cinéticos da dinâmica de transcrição e transcrições individuais de RNA. Um requisito técnico crucial para observar a transcrição de integrações genéticas de um único repórter é a disponibilidade de um sistema de microscópio que permite a detecção de transcrições de RNA únicas rotuladas com o sistema MS2 ou PP7 em células vivas4,12. Aqui, a microscopia de células vivas é realizada em um sistema confocal spinning disk montado em um microscópio invertido, equipado com lasers de estado sólido de 100 mW acoplados a um filtro acústico-óptico tunable como descrito em outros lugares24. Além disso, para estudar a transcrição em um único DSB usando os repórteres, as células individuais devem ser cuidadosamente monitoradas para alcançar a resolução de maior tempo, o que requer células de imagem por várias horas, tornando este um ensaio de baixo rendimento. Ainda assim, observamos várias células em paralelo com o posicionamento controlado por um estágio de microscópio orientado por piezo. Para garantir condições ambientais ideais para observação de células vivas durante horas, o corpo do microscópio, incluindo o estágio amostral, é colocado dentro de uma câmara ambiental plexiglass. Além disso, uma câmara de incubação de estágio fechado é montada no estágio do microscópio e conectada aos controladores de co2 e umidade.
O primeiro passo crítico no protocolo é a seleção de regiões de interesse com células para imagem. Cada posição XY marcada para imagem deve conter uma ou mais células que mostrem transfecção com as proteínas fluorescentes de ligação de alça-tronco RNA de acordo com o gene repórter e esquema de transfecção descrito na Seção 1, Tabela 1, bem como na Figura 2D, E. Além disso, as células devem apresentar locais de transcrição rotulados brilhantes devem ser co-transfecidos com a construção I-SceI-GR-iRFP713, e a proteína deve ser localizada inicialmente no citoplasma (Figura 2D e E).
As células devem mostrar um nível de intensidade de fluorescência de proteína de casaco MS2 e/ou PP7 com marca fluorescente desvinculação baixa o suficiente para detectar transcrições rotuladas únicas sobre o nível de fluorescência de fundo. Ao mesmo tempo, um nível robusto de intensidade de fluorescência das proteínas fluorescentes de revestimento MS2 e/ou PP7 é necessário para permitir imagens ao longo de pelo menos 60 min sem perder muita fluorescência devido a algum branqueamento que ocorre. O “Display de imagem escala” com um intervalo fixo como descrito na Seção 3.7 é usado para permitir uma seleção padronizada de células de acordo com seu nível de intensidade de fluorescência.
Um segundo passo crítico do protocolo é adicionar o TA às células em posições XY pré-determinadas através do pequeno orifício na tampa do prato de fundo de vidro. Qualquer manipulação do prato de fundo de vidro causaria uma mudança da posição XY marcada das células e deve ser evitada. Portanto, manusear cuidadosamente a micropipette ao adicionar o TA diluído no meio de crescimento celular é vital para a observação bem sucedida das células pré-selecionadas, como demonstrado na Figura 2F. A adaptação de diferentes sistemas para adicionar drogas às células montadas em um estágio de microscópio, como um sistema de perfusão, exigiria uma câmara de incubação de estágio separado com aberturas de entrada e saída de tubos e um sistema de bomba ou injeção para administrar drogas. Outros métodos, como slides de canal com superfícies inferiores semelhantes a deslizamentos, resultam em uma difusão lenta de drogas administradas no canal e causam um atraso adicional entre a adição e o efeito da droga. Finalmente, a tubulação incauto em uma abertura de slides de canal também pode mudar a posição da amostra. Portanto, o sistema atual com um orifício personalizado na tampa de um prato de fundo de vidro é simples de se adaptar, de baixo custo e adequado para administrar diferentes mídias de crescimento, drogas e componentes. O pequeno diâmetro do orifício e a atmosfera umidificada na câmara de incubação do estágio também impede a secagem do meio celular.
Um terceiro passo crítico neste protocolo é a análise de dados, que requer uma inspeção manual dos pontos de tempo quando a transcrição cessa devido à indução de um DSB. O ponto de tempo de transcrição terminante é indicado pela liberação das últimas transcrições do site anteriormente brilhante rotulado da transcrição genética do repórter. Da mesma forma, os eventos de iniciação de transcrição induzida por invasão devem ser inspecionados com cuidado para detectar eventos de transcrição individuais com a relação sinal-ruído relativamente baixa de mRNAs rotulados fluorescentes.
A dinâmica de reparação do DSB induzido adiciona uma camada extra de complexidade às análises dos dados gerados usando esses repórteres, limitando-os aos primeiros minutos imediatamente após a indução do DSB. A natureza transgênica dos genes repórteres e a natureza rica em repetição das matrizes de loop-tronco MS2 e PP7 podem montar uma paisagem cromatina única, interferindo no estabelecimento de programas de transcrição estável e estável putativos. No entanto, em comparação com a irradiação ionizante ou UV, a indução mediada pelo I-SceI de um DSB em genes de repórteres é um sistema muito mais robusto para investigar a transcrição em DSBs individuais.
Diferentes sistemas de endonuclease, como I-CreI, I-PpoI ou AsiSI que têm ou não locais de reconhecimento adicionais dentro do genoma humano podem ser combinados com os atuais sistemas genéticos repórteres para uma possível maior eficiência de gerar DSBs. No entanto, eles exigem primeiro introduzir o site de reconhecimento de endonuclease nos genes dos repórteres. Em segundo lugar, eles podem ter uma variabilidade semelhante no tempo e indução de eficiência de um DSB em células individuais. Por outro lado, inserir cópias tandem de sites de reconhecimento de endonuclease pode aumentar a eficiência da indução de DSB. Além disso, testar os sistemas genéticos de repórteres apresentados em diferentes linhas celulares permitiria a comparação da dinâmica de transcrição em locais DSB entre diferentes origens celulares e a disponibilidade de diferentes vias de reparação de danos de DNA, como em células cancerosas, células primárias e células não ciclistas diferenciadas. No entanto, a construção dos genes repórteres para ser compatível com o sistema Flp/FRT está atualmente limitando a integração em linhas de células hospedeiras Flp/FRT disponíveis.
Além das aplicações baseadas em microscopia, os genes atuais do repórter também podem ser combinados com ensaios bioquímicos, como a imunoprecipitação de cromatina, para estudar o recrutamento de fatores de reparação de DNA ou transcrição para um único DSB ou para avaliar a ocupação nucleossomo, modificações de histona e estado de cromatina ao redor do local do DSB. Além disso, uma combinação com diferentes sistemas de repórteres permitiria o estudo de ligações funcionais entre danos ao DNA e processos como organização do genoma ou replicação de DNA.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos rh singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca por presentes de plasmídeos e reagentes. Também estamos em dívida com a equipe do IMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento e J. Rino, para leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 e PTDC/MED-OUT/4301/2020 da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal e por LISBOA-01-0145-FEDER-007391, projeto cofundado pela FEDER através da POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa, e FCT. O financiamento também foi recebido do Programa de Pesquisa e Inovação da EU Horizon 2020 (RiboMed 857119). M.A. é o beneficiário da bolsa de doutorado da FCT 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |