Questo protocollo presenta un nuovo sistema genico reporter e la configurazione sperimentale per rilevare la trascrizione a rotture a doppio filamento di DNA con sensibilità a singola molecola.
Le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono il tipo più grave di danno al DNA. Nonostante le conseguenze catastrofiche sull’integrità del genoma, rimane finora elusivo il modo in cui i DSB influenzano la trascrizione. Una ragione di ciò era la mancanza di strumenti adeguati per monitorare contemporaneamente la trascrizione e l’induzione di un DSB genico con sufficiente risoluzione temporale e spaziale. Questo lavoro descrive una serie di nuovi reporter che visualizzano direttamente la trascrizione in cellule vive immediatamente dopo l’induzione di un DSB nel modello di DNA. Gli stem-loop dell’RNA batteriofago sono impiegati per monitorare la trascrizione con sensibilità a singola molecola. Per indirizzare il DSB a una specifica regione genica, i geni reporter sono progettati per contenere una singola sequenza di riconoscimento dell’endonucleasi di homing I-SceI, altrimenti assente dal genoma umano. Una singola copia di ogni gene reporter è stata integrata nel genoma delle linee cellulari umane. Questo sistema sperimentale permette la rilevazione di singole molecole di RNA generate dalla trascrizione genica canonica o dall’inizio della trascrizione indotta da rottura del DNA. Questi reporter offrono un’opportunità senza precedenti per interpretare le interazioni reciproche tra trascrizione e danno al DNA e per rivelare aspetti finora non apprezzati della trascrizione indotta dalla rottura del DNA.
Le rotture a doppio filamento del DNA (DSB) sono lesioni tossiche del DNA che interrompono la funzione cellulare e contribuiscono all’insorgenza di diverse malattie e all’invecchiamento1. Le mutazioni derivanti dalla riparazione imprecisa dei DSB influenzano l’espressione genica e pongono le basi per il declino funzionale della cellula. L’opinione emergente che i DSB guidino la trascrizione indotta da rotture de novo nel sito della lesione2,3,4,5,6,7 suggerisce che i DSB possono anche influenzare la funzione cellulare attraverso RNA indotti da rottura. Diversi studi recenti indicano che i DSB sono sufficienti per avviare la trascrizione programmata (ad esempio, a geni inducibili dallo stimolo) e non programmata (ad esempio, a promotori non canonici)4,5,7. Tuttavia, nonostante diversi studi che esplorano i legami tra danno al DNA e trascrizione, il campo è ancora in ritardo nella sua capacità di fornire una caratterizzazione precisa (cioè a singola molecola) degli eventi trascrizionali nei siti di rottura del DNA. Una ragione importante per questo era la mancanza di strumenti sperimentali appropriati. L’irradiazione cellulare (raggi γ, raggi X, ioni pesanti) e i trattamenti farmacologici (ad esempio, inibitori della topoisomerasi o agenti intercalanti) mancano di precisione spaziale e inducono lesioni del DNA diverse dai DSB, comprese le rotture a singolo filamento e gli addotti del DNA8. Le endonucleasi, come I-PpoI e AsiSI, generano DSB locus-specific ma non sono state combinate con un sistema che consenta la visualizzazione simultanea della trascrizione in un singolo locus con elevata precisione temporale8. Per aggirare questa limitazione, il nostro laboratorio ha guidato lo sviluppo di una serie di reporter all’avanguardia che visualizzano direttamente la trascrizione con risoluzione a singola molecola sull’induzione controllata di un DSB4 unico. Qui, descriviamo questi reporter, forniamo un protocollo dettagliato per l’imaging di cellule vive della trascrizione a DSB e mostriamo i dati che rivelano l’inizio della trascrizione in un singolo DSB.
I sistemi genici reporter utilizzati in questo protocollo si basano sul gene reporter IgM di topo ben caratterizzato e contengono gli esoni M1 e M2 della forma legata alla membrana (μm) della catena pesante IgM μ 9,10,11. Un introne ibrido separa i due esoni con il tratto PY adenovirus major late transcript (AdML) forte12. L’espressione dei geni reporter è controllata dal promotore del citomegalovirus umano (CMV), in cui sono state inserite due copie tandem della sequenza dell’operatore Tet (TetO). I geni reporter sono inseriti ciascuno in un vettore plasmidico contenente un sito Flp Recombination Target (FRT) e inseriti in uno specifico sito target FRT nel genoma di una linea cellulare ospite HEK293. Questa linea cellulare esprime anche costitutivamente la proteina repressore Tet per regolare l’espressione del gene reporter attraverso la presenza o l’assenza di tetraciclina/doxiciclina. Per consentire la visualizzazione della trascrizione del gene reporter, sono state inserite 24 ripetizioni tandem della sequenza del loop stem MS2 e 24 ripetizioni tandem della sequenza stem loop PP7 in posizioni diverse rispetto al sito di inizio della trascrizione e alla struttura dell’esone/ introne del gene reporter. I loop dello stelo dell’RNA MS2/PP7 si formano al momento della trascrizione e sono specificamente legati da proteine del mantello MS2/PP7 espresse ectopicamente marcate con proteine fluorescenti verdi e rosse, una strategia ampiamente utilizzata prima per la trascrizione delle immagini13,14,15. Inoltre, è stata inserita una singola copia della sequenza di riconoscimento a 18 bp per l’endonucleasi di homing I-SceI che è direttamente affiancata dagli array di sequenze stem-loop dell’RNA nei geni reporter. Sono state utilizzate tecniche di clonazione standard per generare tutti i plasmidi, il frammento contenente lo stem-loop I-SceI-24xMS2 del gene reporter PROP è stato sintetizzato da un servizio di sintesi genica commerciale.
Il gene reporter DSB promotore-prossimale (PROP) è stato costruito inserendo il sito di taglio I-SceI 45 coppie di basi (bp) a valle del presunto sito di inizio della trascrizione nell’esone I, seguito da 149 bp fino all’inizio della cassetta 24x MS2 stem-loop, che è stata progettata de novo con due sequenze stem-loop alternate non identiche16 e altre cinque sequenze distanziatrici non ripetitive da 20 bp per ridurre la ridondanza. L’array MS2 stem-loop è seguito da 72 bp fino all’inizio dell’introne 1844 bp e dall’esone II 1085 bp fino al sito di scissione e poliadenilazione. L’esone II codifica per una proteina fluorescente ciano (CFP) fusa in una sequenza di targeting perossisomale C-terminale (PTS) dalla perossisomiale acil-CoA ossidasi umana per consentire uno screening indipendente dell’espressione genica reporter (Figura 1A).
Il gene reporter dell’esone II DSB (EX2) è costituito da un esone I da 167 bp seguito dall’introne e dall’esone II che codificano per il CFP-PTS. Più a valle, a una distanza di 169 bp, è stata inserita una cassetta contenente 24 anelli di stelo MS2, seguita da una sequenza di linker da 84 bp con un sito I-SceI al centro, seguita da 24x PP7 stem-loop e 221 bp fino al sito di scissione e poliadenilazione17 (Figura 1B).
Infine, il gene reporter dell’esone II DSB con marcatura di trascrizione antisenso (EX2AS) si basa sul trascritto del gene dell’ubiquitina B umana (UBB) UBB-201 e contiene due esoni e un introne. L’esone I ha una lunghezza totale di 1534 bp con un inserimento inverso della sequenza stelo-loop MS2 24x. Pertanto, la corretta sequenza di RNA stem-loop MS2 verrà trascritta in una direzione antisenso rispetto alla trascrizione sensoriale del gene reporter dal promotore CMV. L’introne ha una lunghezza di 490 bp, seguito dall’esone II con il sito I-SceI , ed è stata inserita una regione codificante per due subunità di ubiquitina in-frame. A valle del gene UBB c’è una sequenza che forma un ciclo di stelo PP7 24x alla trascrizione del gene reporter in una direzione di senso (Figura 1C).
La trasfezione transitoria di un costrutto inducibile dell’endonucleasi di homing I-SceI consente la creazione controllata di un DSB nel sito di riconoscimento inserito all’interno di ciascun gene reporter18. L’endonucleasi I-SceI è fusa in frame con il dominio legante il ligando del recettore glucocorticoide e una proteina fluorescente rosso lontano iRFP713. Questo costrutto è citoplasmatico in assenza di triamcinolone acetonide (TA) ma migra rapidamente nel nucleo con l’aggiunta di TA al mezzo di crescita delle cellule (Figura 1D). L’induzione dei DSB da parte del sistema I-SceI è robusta, come dimostrato prima18,19,20. La trascrizione del gene reporter può essere monitorata in parallelo visualizzando i sistemi di stem-loop di RNA marcati in modo fluorescente MS2 e PP7.
I conflitti tra processi biologici essenziali come la replicazione, la trascrizione, il danno al DNA e la riparazione del DNA sono stati identificati come una fonte critica di instabilità del genoma22. Questi studi hanno anche portato alla scoperta della trascrizione nei siti di danno al DNA e hanno attribuito un ruolo funzionale ai trascritti indotti dalla rottura nella regolazione dei processi di riparazione del danno al DNA23. I nuovi strumenti e il protocollo qui descritto consentono ulteriori indagini sulle dinamiche di trascrizione dell’RNA Pol II presso i DSB. Un punto critico in questo protocollo è la generazione di linee cellulari che contengono una singola copia del gene reporter integrato nel genoma. Questa caratteristica chiave elimina il rumore creato dalla trascrizione di diversi geni reporter integrati con più copie all’interno di un singolo locus genomico e consente la raccolta di parametri cinetici delle dinamiche di trascrizione e dei singoli trascritti di RNA. Un requisito tecnico cruciale per osservare la trascrizione di singole integrazioni geniche reporter è la disponibilità di un sistema al microscopio che consenta la rilevazione di singoli trascritti di RNA etichettati con il sistema MS2 o PP7 in cellule vive4,12. Qui, la microscopia a cellule vive viene eseguita su un sistema Confocal Spinning Disk montato su un microscopio invertito, dotato di laser a stato solido da 100 mW accoppiati a un filtro sintonizzabile acustico-ottico come descritto altrove24. Inoltre, per studiare la trascrizione in un singolo DSB utilizzando i reporter, le singole cellule devono essere attentamente monitorate per ottenere la massima risoluzione temporale, che richiede l’imaging delle cellule per diverse ore, rendendo questo un test a basso rendimento. Tuttavia, osserviamo diverse cellule in parallelo con il posizionamento controllato da uno stadio di microscopio piezo-guidato. Per garantire condizioni ambientali ottimali per l’osservazione di cellule vive per ore, il corpo del microscopio, compreso lo stadio del campione, viene posizionato all’interno di una camera ambientale in plexiglass. Inoltre, una camera di incubazione a stadio chiuso è montata sullo stadio del microscopio e collegata ai controller di alimentazione di CO2 e umidità.
Il primo passo critico nel protocollo è la selezione delle regioni di interesse con le cellule per l’imaging. Ogni posizione XY contrassegnata per l’imaging deve contenere una o più cellule che mostrano la trasfezione con le proteine leganti l’anello staminale dell’RNA fluorescente secondo il gene reporter e lo schema di trasfezione descritti nella Sezione 1, Tabella 1, nonché nella Figura 2D, E. Inoltre, le cellule devono presentare siti di trascrizione luminosi etichettati devono essere co-trasfettati con il costrutto I-SceI-GR-iRFP713 e la proteina deve essere localizzata inizialmente nel citoplasma (Figura 2D ed E).
Le cellule dovrebbero mostrare un livello di intensità di fluorescenza della proteina MS2 e/o PP7 marcata fluorescentemente non legata abbastanza bassa da rilevare singoli trascritti marcati sul livello di fluorescenza di fondo. Allo stesso tempo, è necessario un robusto livello di intensità di fluorescenza delle proteine del mantello MS2 e/o PP7 marcate fluorescentemente per consentire l’imaging per almeno 60 minuti senza perdere troppa fluorescenza a causa di uno sbiancamento che si verifica. Il “Display di immagini in scala” con un intervallo fisso come descritto nella Sezione 3.7 viene utilizzato per consentire una selezione standardizzata delle celle in base al loro livello di intensità di fluorescenza.
Un secondo passo critico del protocollo è l’aggiunta del TA alle celle in posizioni XY predeterminate attraverso il piccolo foro nel coperchio del piatto di fondo di vetro. Qualsiasi manipolazione del piatto di fondo di vetro causerebbe uno spostamento dalla posizione XY marcata delle cellule e deve essere evitata. Pertanto, maneggiare attentamente la micropipetta mentre si aggiunge l’AT diluito nel mezzo di crescita cellulare è vitale per l’osservazione di successo delle cellule preselezionate, come dimostrato nella Figura 2F. L’adattamento di diversi sistemi per aggiungere farmaci alle cellule montate su uno stadio di microscopio, come un sistema di perfusione, richiederebbe una camera di incubazione dello stadio separata con aperture di ingresso e uscita del tubo e una pompa o un sistema di iniezione per somministrare farmaci. Altri metodi come le diapositive del canale con superfici inferiori simili a coverslip provocano una lenta diffusione dei farmaci somministrati nel canale e causano un ulteriore ritardo tra l’aggiunta di farmaci e l’effetto. Infine, il pipettaggio incauto in un’apertura a scorrimento del canale può spostare anche la posizione del campione. Pertanto, l’attuale sistema con un foro praticato personalizzato nel coperchio di un piatto con fondo di vetro è semplice da adattare, a basso costo e adatto per la somministrazione di diversi mezzi di crescita, farmaci e componenti. Il piccolo diametro del foro e l’atmosfera umidificata nella camera di incubazione dello stadio impediscono anche l’essiccazione del mezzo cellulare.
Un terzo passo critico in questo protocollo è l’analisi dei dati, che richiede un’ispezione manuale dei punti temporali quando la trascrizione cessa a causa dell’induzione di un DSB. Il punto temporale di terminare la trascrizione è indicato rilasciando le ultime trascrizioni dal sito precedentemente brillante della trascrizione del gene reporter. Allo stesso modo, gli eventi di inizio della trascrizione indotta da rottura devono essere ispezionati con cura per rilevare singoli eventi di trascrizione con il rapporto segnale-rumore relativamente basso dei singoli mRNA marcati fluorescentemente.
La dinamica di riparazione del DSB indotto aggiunge un ulteriore livello di complessità alle analisi dei dati generati utilizzando questi reporter, limitandoli ai primi minuti immediatamente dopo l’induzione del DSB. La natura transgenica dei geni reporter e la natura ricca di ripetizioni degli array stem-loop MS2 e PP7 possono assemblare un paesaggio cromatinico unico, interferendo con la creazione di presunti programmi di trascrizione indotta da rottura stabili. Tuttavia, rispetto all’irradiazione ionizzante o UV, l’induzione mediata da I-SceI di un DSB nei geni reporter è un sistema molto più robusto per studiare la trascrizione nei singoli DSB.
Diversi sistemi di endonucleasi come I-CreI, I-PpoI o AsiSI che hanno o non hanno siti di riconoscimento aggiuntivi all’interno del genoma umano possono essere combinati con gli attuali sistemi genici reporter per una possibile maggiore efficienza di generazione di DSB. Tuttavia, richiedono prima l’introduzione del sito di riconoscimento dell’endonucleasi nei geni reporter. In secondo luogo, possono avere una variabilità simile sull’induzione dei tempi e dell’efficienza di un DSB nelle singole cellule. D’altra parte, l’inserimento di copie in tandem di siti di riconoscimento dell’endonucleasi può aumentare l’efficienza dell’induzione DSB. Inoltre, testare i sistemi genici reporter presentati in diverse linee cellulari consentirebbe il confronto delle dinamiche di trascrizione nei siti DSB tra diversi background cellulari e la disponibilità di diversi percorsi di riparazione del danno al DNA come nelle cellule tumorali, nelle cellule primarie e nelle cellule differenziate non cicliche. Tuttavia, la costruzione dei geni reporter per essere compatibili con il sistema Flp/FRT sta attualmente limitando l’integrazione nelle linee cellulari ospiti Flp/FRT disponibili.
Oltre alle applicazioni basate sulla microscopia, gli attuali geni reporter possono anche essere combinati con saggi biochimici, come l’immunoprecipitazione della cromatina, per studiare il reclutamento di fattori di riparazione o trascrizione del DNA in un singolo DSB o per valutare l’occupazione del nucleosoma, le modifiche degli istoni e lo stato della cromatina intorno al sito DSB. Inoltre, una combinazione con diversi sistemi di reporter consentirebbe lo studio dei collegamenti funzionali tra il danno al DNA e processi come l’organizzazione del genoma o la replicazione del DNA.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca per i doni di plasmidi e reagenti. Siamo anche in debito con lo staff di iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento e J. Rino, per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 e PTDC/MED-OUT/4301/2020 da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portogallo e da LISBOA-01-0145-FEDER-007391, progetto cofinanziato da FEDER attraverso POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa e FCT. I finanziamenti sono stati ricevuti anche dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’UE (RiboMed 857119). M.A. è il destinatario della borsa di studio FCT Ph.D. 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |