このプロトコルは、新しいレポーター遺伝子システムと、一分子感受性を有するDNA二本鎖破断時の転写を検出するための実験的セットアップを提示する。
DNA二本鎖切断(DSB)は、DNA損傷の最も深刻なタイプです。ゲノム完全性に壊滅的な影響を及ぼすにもかかわらず、DSBが転写にどのような影響を与えるかは、これまでのところ不可解なままです。その理由は、転写を同時に監視するための適切なツールの欠如と、十分な時間的および空間的解像度を持つ新しいDSBの誘導であった。この研究は、DNAテンプレートでDSBが誘導された直後に生細胞の転写を直接可視化する新しいレポーターのセットを記述する。バクテリオファージRNAステムループは、単一分子感受性で転写を監視するために使用される。DSBを特定の遺伝子領域にタージングするために、レポーター遺伝子はホーミングエンドヌクレアーゼ I-SceIの単一の認識配列を含む、それ以外の場合はヒトゲノムから存在しない組み合わせて設計される。各レポーター遺伝子の単一のコピーがヒト細胞株のゲノムに統合された。この実験システムは、正規遺伝子転写またはDNA破壊誘発転写開始によって生成された単一RNA分子の検出を可能にする。これらの記者は、転写とDNA損傷の間の相互相互作用を解釈し、DNA破壊誘発転写の評価されていない側面を開示する前例のない機会を提供する。
DNA二本鎖切断(DSB)は、細胞機能を破壊し、いくつかの疾患および老化の反乱に寄与する有毒なDNA病変である。DSBの不正確な修復に起因する突然変異は、遺伝子発現に影響を与え、細胞の機能的衰退の基礎を設定する。 DSBsが病変部位でノボ破断誘発転写を駆動するという明らかになった見解は、DSBが破断誘発RNAを介して細胞機能にも影響を与える可能性があることを示唆している。いくつかの最近の研究は、DSBがプログラム(例えば、刺激誘発性遺伝子で)および予定外(例えば、非正規プロモーターで)転写を開始するのに十分であることを示している4,5,7。しかし、DNA損傷と転写の間のリンクを探求するいくつかの研究にもかかわらず、この分野は依然としてDNA破壊部位における転写事象の正確な(すなわち単一分子)特徴付けを提供する能力に遅れをとった。その重要な理由の1つは、適切な実験ツールの欠如でした。細胞照射(γ線、X線、重イオン)および薬物治療(例えば、トポイソメラーゼ阻害剤またはインターカロ剤)は、空間的な精度を欠き、一本鎖切断およびDNA付加物8を含むDSB以外のDNA病変を誘導する。I-PpoIやAsiSIなどのエンドヌクレアーゼは、遺伝子座特異的なDSBを生成しますが、高精度の単一の遺伝子座で同時に生細胞の転写を可視化できるシステムと組み合わせられていない8。この制限を回避するために、私たちの研究室は、ユニークなDSB4の制御誘導時に単一分子分解能で転写を直接視覚化する最先端のレポーターのセットを開発しました。ここでは、これらのレポーターについて説明し、DSBでの転写の生細胞イメージングのための詳細なプロトコルを提供し、単一のDSBで転写開始を明らかにするデータを示す。
このプロトコルで使用されるレポーター遺伝子系は、よく特徴づけられたマウスIgMレポーター遺伝子に基づいており、重鎖9,10,11のIgM μ膜結合形態のエキソンM1およびM2を含有する。ハイブリッドイントロンは、強いアデノウイルス主要後期転写物(AdML)PY tract12を有する2つのエキソンを分離する。レポーター遺伝子の発現は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター(CMV)によって制御され、テト操作体(TetO)配列の2つのタンデムコピーが挿入されている。レポーター遺伝子は、それぞれFlp組換え標的(FRT)部位を含むプラスミドベクターに挿入され、HEK293宿主細胞株のゲノム中の特定のFRT標的部位に挿入される。この細胞株はまた、テトラサイクリン/ドキシサイクリンの有無を介してレポーター遺伝子の発現を調節するテットリプレッサータンパク質を構成的に発現する。レポーター遺伝子転写の可視化を可能にするために、PP7ステムループ配列のMS2ステムループ配列の24タンデム反復と24タンデム反復を、レポーター遺伝子の転写開始部位およびエキソン/イントロン構造に関して異なる位置に挿入した。MS2/PP7 RNAステムループは転写時に形成され、緑色および赤色の蛍光タンパク質でタグ付けされた異所性MS2/PP7コートタンパク質によって特異的に結合され、以前は転写13,14,15を画像化するために広く使用されている戦略です。さらに、18 bp認識配列の単一のコピーを、レポーター遺伝子内のRNAステムループ配列によって直接横たわっているホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIに挿入した。標準クローニング技術は、全てのプラスミドを生成するために使用され、PROPレポーター遺伝子のI-SceI-24xMS2ステムループを含む断片を、市販遺伝子合成サービスによって合成した。
プロモーター近位DSBレポーター遺伝子(PROP)は、エキソンIの推定転写開始部位のI-SceI切断部位45塩基対(bp)を挿入し、続いて24倍MS2ステムループカセットの開始まで149 bpを挿入して構築した。 冗長性を低減するために、さらに5つの非反復的な20 bpスペーサーシーケンスを追加します。MS2ステムループアレイは、1844 bpイントロンの始まりまで72 bp、切断およびポリアデニル化部位まで1085 bpエキソンIIが続きます。エキソンIIは、レポーター遺伝子発現の独立したスクリーニングを可能にするヒトペルオキシソマルアシルCoAオキシダーゼからC末端ペルオキシソーム標的配列(PTS)に融合したシアン蛍光タンパク質(CFP)をコードする(図1A)。
エキソンII DSBレポーター遺伝子(EX2)は、167 bpのエキソンと続くイントロンとエキソンIIがCFP-PTSをコードする。さらに169bpの距離で下流に、24倍MS2ステムループを含むカセットを挿入し、続いて I-SceI 部位を中心に84bpリンカー配列を挿入し、続いて24倍PP7ステムループと221bpが切断およびポリアデニル化部位17 まで続いた(図1B)。
最後に、アンチセンス転写標識(EX2AS)を有するエキソンII DSBレポーター遺伝子は、ヒトユビキチンB(UBB)遺伝子転写UBB-201に基づいており、2つのエキソンと1つのイントロンが含まれています。エキソンIは、24倍MS2のステムループシーケンスの逆挿入を伴う1534 bpの全長を有する。したがって、正しいMS2ステムループRNA配列は、CMVプロモーターからのレポーター遺伝子のセンス転写に関してアンチセンス方向に転写される。イントロンは490 bpの長さを有し、続いて I-SceI 部位を有するエキソンIIが続き、2つのインフレームユビキチンサブユニットに対して符号化領域が挿入された。UBB遺伝子の下流は、レポーター遺伝子をある意味方向に転写した際に24倍PP7ステムループを形成する配列である(図1C)。
ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIの誘導性構築物の一時的なトランスフェクションは、各レポーターgene18内の挿入された認識部位でのDSBの制御された作成を可能にする。I-SceIエンドヌクレアーゼは、グルココルチコイド受容体のリガンド結合ドメインと遠赤色蛍光タンパク質iRFP713とフレーム内で融合している。この構築物は、トリアムシノロンアセトニン(TA)の存在の細胞質であるが、細胞の増殖培地にTAを添加すると核に急速に移行する(図1D)。I-SceIシステムによるDSBの誘導は、18,19,20の前に示されているように堅牢です。レポーター遺伝子転写は、蛍光タグ付きRNAステムループシステムMS2とPP7を可視化することにより、並列に監視することができる。
複製、転写、DNA損傷、DNA修復などの重要な生物学的プロセス間の競合は、ゲノム不安定性の重要な原因として同定されている22.これらの研究はまた、DNA損傷部位における転写の発見につながり、DNA損傷修復プロセスを調節する際の破断誘発転写産物に機能的役割を有する23を有する。ここで説明する新しいツールとプロトコルにより、DSB における RNA Pol II 転写ダイナミクスのさらなる調査が可能になります。このプロトコルの重要なポイントは、ゲノムに統合されたレポーター遺伝子の単一のコピーを含む細胞株の生成である。この重要な特徴は単一のゲノムの軌跡の多数の写しと統合される複数のレポーター遺伝子の転写によって作成される騒音を除去し、転写力学および個々のRNA転写物の運動学的パラメータの収集を可能にする。単一レポーター遺伝子の組み込み転写を観察するための重要な技術的要件は、生細胞4,12のMS2またはPP7系で標識された単一のRNA転写物の検出を可能にする顕微鏡システムの利用可能性です。ここでは、反転顕微鏡に搭載された共焦点回転ディスクシステム上で生細胞顕微鏡を行い、他の場所で説明されているように音響光学調整可能なフィルタに結合された100mWの固体レーザーを搭載した。さらに、レポーターを用いて単一のDSBで転写を研究するには、個々の細胞を注意深く監視して、数時間の画像化を必要とする最高の時間分解能を達成する必要があり、これを低スループットアッセイにする必要があります。それでも、ピエゾ駆動型顕微鏡ステージで制御される位置と並行して複数の細胞を観察します。数時間にわたる生きた細胞観察のための最適な環境条件を確保するために、サンプルステージを含む顕微鏡体は、プレキシガラス環境室の中に置かれる。さらに、閉じたステージインキュベーション室を顕微鏡ステージに取り付け、CO2と湿度供給コントローラに接続します。
プロトコルの最初の重要なステップは、イメージング用のセルを持つ対象領域の選択です。画像化のためにマークされた各XY位置は、図2D、Eに記載されているレポーター遺伝子およびトランスフェクションスキームに従った蛍光RNAステムループ結合タンパク質とのトランスフェクションを示す1つ以上の細胞を含まなければならない。さらに、細胞は明るい標識転写部位を示さなければならないI-SceI-GR-iRFP713コンストラクトと共にトランスフェクトされ、タンパク質は最初に細胞質に局在する必要があります(図2DおよびE)。
細胞は、バックグラウンド蛍光レベルで単一標識された転写物を検出するのに十分低い、蛍光タグ付きMS2および/またはPP7コートタンパク質の蛍光強度レベルを示すべきである。同時に、蛍光タグ付きMS2および/またはPP7コートタンパク質の堅牢な蛍光強度レベルは、発生するいくつかの漂白のためにあまりにも多くの蛍光を失うことなく、少なくとも60分以上のイメージングを可能にするために必要です。セクション3.7に記載されているように固定範囲の「スケール画像表示」は、それらの蛍光強度レベルに応じて細胞の標準化された選択を可能にするために使用される。
第2の重要なプロトコルステップは、ガラス底皿の蓋の小さな穴を通して、事前に決定されたXY位置の細胞にTAを追加することです。ガラス底皿の操作は、細胞のマークされたXY位置からのシフトを引き起こし、避けなければなりません。したがって、細胞増殖培地に希釈されたTAを添加しながらマイクロピペットを慎重に取り扱うことは、事前選択された細胞の観察を成功させるために不可欠であり、 図2Fに示すように。灌流システムなどの顕微鏡ステージに搭載された細胞に薬物を追加するための異なるシステムの適応には、チューブの入り口と出口の開口部を備えた別のステージインキュベーションチャンバーと、薬物を投与するためのポンプまたは注射システムが必要です。カバースリップのような底面を持つチャネルスライドのような他の方法は、チャネルへの投与薬物の拡散が遅くなり、薬物の添加と効果の間にさらなる遅延を引き起こす。最後に、チャネルスライド開口部への慎重なピペット化は、サンプル位置もシフトする可能性がある。したがって、ガラス底皿の蓋にカスタムドリル穴を持つ本システムは、容易に適応し、低コストで、異なる成長培地、医薬品、およびコンポーネントを投与するのに適しています。また、ステージインキュベーションチャンバー内の孔の小径と加湿雰囲気も、細胞培地から乾燥を防止します。
このプロトコルの第3の重要なステップは、DSBの誘導のために転写が停止したときの時間ポイントの手動検査を必要とするデータ分析です。転写終了の時点は、レポーター遺伝子転写の以前に明るい標識部位から最後の転写物を放出することによって示される。同様に、ブレイク誘発転写開始のイベントは、単一の蛍光標識mRNAの比較的低いシグナル対雑音比を持つ個々の転写事象を検出するために注意して検査されなければならない。
誘導されたDSBの修復のダイナミクスは、これらのレポーターを使用して生成されたデータの分析に複雑さの余分な層を追加し、DSBの誘導直後の最初の分にそれらを制限します。レポーター遺伝子のトランスジェニックな性質とMS2およびPP7ステムループアレイの繰り返し豊富な性質は、ユニークなクロマチンの風景を組み立て、推定安定した破断誘発転写プログラムの確立を妨げ得る。それにもかかわらず、電離照射またはUV照射と比較して、レポーター遺伝子におけるDSBの I-SceI 媒介誘導は、個々のDSBにおける転写を調査するためのはるかに堅牢なシステムである。
ヒトゲノム内に認識部位を追加または持たないI-CreI、I-PpoI、AsiSIなどの異なるエンドヌクレアーゼシステムを、現レポーター遺伝子システムと組み合わせることで、DSBの生成効率を高めることができます。しかし、彼らはまずレポーター遺伝子にエンドヌクレアーゼ認識部位を導入する必要があります。第二に、それらは、個々の細胞におけるDSBのタイミングおよび効率誘導に同様の変動性を有し得る。一方、エンドヌクレアーゼ認識部位のタンデムコピーを挿入すると、DSB誘導の効率が向上する可能性がある。さらに、異なる細胞株で提示されたレポーター遺伝子系をテストすることで、異なる細胞背景間のDSB部位での転写ダイナミクスの比較と、癌細胞、原発細胞、分化された非循環細胞などの異なるDNA損傷修復経路の可用性を可能にする。しかし、Flp/FRTシステムと互換性のあるレポーター遺伝子の構築は、現在、利用可能なFlp/FRT宿主細胞株への統合を制限している。
顕微鏡ベースのアプリケーションに加えて、現在のレポーター遺伝子は、クロマチン免疫沈降などの生化学的アッセイと組み合わせて、DNA修復因子または転写因子を単一のDSBに採用することを研究するか、またはヌクレオソーム占有率、ヒストン修飾、およびDSB部位の周りのクロマチン状態を評価する。さらに、異なるレポーターシステムとの組み合わせにより、DNA損傷とゲノム組織やDNA複製などのプロセス間の機能的なリンクの研究が可能になります。
The authors have nothing to disclose.
RHシンガー、J.A.チャオ、T.ミステリ、M.カルモ・フォンセカのプラスミドと試薬の贈り物に感謝します。また、iMMバイオイメージング施設のスタッフであるA.テムド、A.ナシメント、J.リノの方にも、原稿を批判的に読んでもらっています。この作品は、PTDC/MED-OUT/32271/2017によって資金提供されました。 PTDC/BIA-MOL/30438/2017 およびPTDC/MED-OUT/4301/2020 から フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア (FCT) (FCT) ポルトガル および LISBOA-01-0145-FEDER-007391, フェデラーが資金を調達した ポルトガル2020-プログラムオペラシオナル地域デリスボア、およびFCT。EU Horizon 2020 リサーチ・イノベーション・プログラム (RiboMed 857119) からも資金が寄せられた。M.A.はFCT博士フェローシップ 2020.05899.BD の受領者です。
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |