פרוטוקול זה מציג מערכת גנים כתב חדשה ואת ההתקנה הניסיונית כדי לזהות שעתוק ב- DNA כפול גדיל נשבר עם רגישות מולקולה אחת.
שברי גדיל כפול DNA (DSB) הם הסוג החמור ביותר של נזק DNA. למרות ההשלכות הקטסטרופליות על שלמות הגנום, זה נשאר עד כה חמקמק איך DSBs להשפיע על שעתוק. סיבה לכך הייתה היעדר כלים מתאימים לניטור סימלול בו זמנית וגיוס של DSB genic עם רזולוציה זמנית ומרחבית מספקת. עבודה זו מתארת קבוצה של כתבים חדשים המדמיינים ישירות את התמלול בתאים חיים מיד לאחר יצירת DSB בתבנית ה- DNA. לולאות גזע RNA בקטריופאג’, משמשות לניטור התמלול ברגישות למולקולה אחת. עבור מיקוד DSB לאזור גנים מסוים, הגנים הכתבים מהונדסים להכיל רצף זיהוי יחיד של אנדונוקלאז ביות I-SceI, אחרת נעדר מהגנום האנושי. עותק יחיד של כל גן עיתונאי שולבו בגנום של קווי התא האנושי. מערכת ניסיונית זו מאפשרת זיהוי של מולקולות RNA בודדות שנוצרו על ידי שעתוק הגנים הקנוניים או על ידי חניכת שעתוק הנגרמת על ידי שבירת DNA. כתבים אלה מספקים הזדמנות חסרת תקדים לפרש את האינטראקציות ההדדיות בין שעתוק לנזק לדנ”א ולחשוף עד כה היבטים לא מוערכים של תמלול המושרה ב- DNA.
הפסקות גדיל כפול DNA (DSBs) הם נגעים DNA רעילים לשבש את תפקוד התא ולתרום להתקוממות של מספר מחלות והזדקנות1. מוטציות הנובעות מתיקון לא מדויק של ביטוי הגנים משפיעות על DSBs ומגדירות את הבסיס לירידה התפקודית של התא. ההשקפה המתהווה כי DSBs לנהוג דה נובו שבירת תעתיק באתר הנגע2,3,4,5,6,7 מציע כי DSBs עשוי להשפיע גם על תפקוד התא באמצעות RNAs המושרה פריצה. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה מצביעים על כך ש- DSBs מספיקים כדי ליזום תמלול מתוכנת (למשל, בגנים שאינם ניתנים לגירוי) ולא מתוזמן (למשל, אצל מקדמים לא קנוניים) תמלול4,5,7. עם זאת, למרות מספר מחקרים שבדקו את הקשרים בין נזק לדנ”א לתעתיק, התחום עדיין מפגר ביכולתו לספק אפיון מדויק (כלומר, מולקולה אחת) של אירועי התמלול באתרי שבירת DNA. אחת הסיבות החשובות לכך הייתה היעדר כלים ניסיוניים מתאימים. הקרנת תאים (γ צילומי רנטגן, יונים כבדים) וטיפולים תרופתיים (למשל, מעכבי topoisomerase או חומרים מתערבים) חסרים דיוק מרחבי ומעוררים נגעים ב- DNA מלבד DSBs, כולל שברים חד-גדיליים ותוספות DNA8. אנדונוקלאזים, כגון I-PpoI ו- AsiSI, יוצרים DSBs ספציפיים ללוק, אך לא שולבו עם מערכת המאפשרת הדמיה סימולטנית של תאים חיים של תמלול בלוקוס יחיד עם דיוק טמפורלי גבוה8. כדי לעקוף מגבלה זו, המעבדה שלנו הובילה פיתוח קבוצה של כתבים חדשניים שמדמיינים ישירות תמלול עם רזולוציה של מולקולה אחת על אינדוקציה מבוקרת של DSB4 ייחודי. כאן, אנו מתארים כתבים אלה, מספקים פרוטוקול מפורט להדמיה של תאים חיים של תמלול ב- DSBs ומציגים נתונים החושפים ייזום תמלול ב- DSB יחיד.
מערכות הגנים הכתביות המשמשות בפרוטוקול זה מבוססות על הגן העיתונאי IgM של העכבר המאופיין היטב ומכילים את ה- exons M1 ו- M2 של הצורה הקשורה לממברנה (מיקרומטר) של השרשרת הכבדה μ IgM9,10,11. אינטרון היברידי מפריד בין שני האקסונים עם תעתיק מאוחר אדנווירוס חזק (AdML) PY עלון12. הביטוי של הגנים הכתב נשלט על ידי מקדם cytomegalovirus האנושי (CMV), שבו שני עותקים דו-מושביים של מפעיל טט (TetO) רצף הוכנסו. הגנים הכתבים מוכנסים כל אחד לווקטור פלסמיד המכיל אתר יעד Recombination Flp (FRT) ומוכנסים לאתר יעד FRT ספציפי בגנום של קו תא מארח HEK293. קו תא זה גם מבטא באופן מרכיב את חלבון דכאן טט כדי לווסת את הביטוי של הגן הכתב באמצעות נוכחות או היעדר טטרציקלין / דוקסיציקלין. כדי לאפשר הדמיה של תמלול הגן הכתב, 24 חזרות דו-מושביות של רצף לולאת גזע MS2 ו-24 חזרות דו-מושביות של רצף לולאת הגזע של PP7 הוכנסו למיקומים שונים ביחס לאתר התחלת התמלול ומבנה אקסון/אינטרון של הגן הכתב. לולאות גזע הרנ”א MS2/PP7 נוצרות בעת שעתוק וכבולות במיוחד לחלבוני מעיל MS2/PP7 המתויגים בחלבוני פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים, אסטרטגיה שהייתה בשימוש נרחב בעבר לתעתיק תמונה13,14,15. בנוסף, הוכנס עותק יחיד של רצף הזיהוי של 18 bp עבור ה- I-SceI של ה- endonuclease ביות, המוקפת ישירות על-ידי מערכי רצף לולאת גזע RNA בגנים הכתבים. טכניקות שיבוט סטנדרטיות שימשו ליצירת כל הפלסמידים, הקטע המכיל את לולאת הגבעול I-SceI-24xMS2 של הגן כתב PROP היה מסונתז על ידי שירות סינתזת גנים מסחרי.
הגן כתב DSB (PROP) של האמרגן הפרוקסימלי של האמרגן נבנה על ידי הכנסת אתר חיתוך I-SceI 45 זוגות בסיס (bp) במורד הזרם של אתר ההתחלה של תמלול putative ב- exon I, ואחריו 149 bp עד תחילת קלטת לולאת הגזע 24x MS2, אשר תוכננה דה נובו עם שני רצפי לולאת גזע לא זהים לסירוגין16 וחמישה רצפי רווחים נוספים שאינם חוזרים על 20 bp כדי להפחית את היתירות. מערך לולאת הגבעול MS2 מלווה ב- 72 bp עד תחילת אינטרון 1844 bp ו- 1085 bp אקסון II עד לאתר המחשוף והפוליאדנילציה. האקסון II מקודד חלבון ציאן פלואורסצנטי (CFP) התמזג לרצף פילוח פרוקסיזום C-terminal (PTS) מ acyl CoA אוקסידאז פרוקסיזום האנושי כדי לאפשר הקרנה עצמאית של ביטוי הגנים הכתב (איור 1A).
גן כתב ה- DSB אקסון II (EX2) מורכב מאקסון של 167 bp ואחריו האינטרטרון והאקסון השני קידוד CFP-PTS. בהמשך הזרם במרחק של 169 סיביות לפנה”ס, הוכנסה קלטת המכילה לולאות גזע MS2 24x MS2, ואחריה רצף מקשר 84 bp עם אתר I-SceI במרכז, ואחריו לולאות גזע PP7 24x ו- 221 bp עד לאתר המחשוף והפוליאדנילציה17 (איור 1B).
לבסוף, גן כתב ה- DSB exon II עם תיוג שעתוק אנטיסנס (EX2AS) מבוסס על תעתיק הגן האנושי UBB-201 המכיל שני אקסונים ואחד אינטרון. האקסון יש לי אורך כולל של 1534 bp עם הכנסה הפוכה של רצף לולאת גזע MS2 24x. לכן, רצף הרנ”א הנכון של לולאת גזע MS2 יתעתק בכיוון אנטיסנס ביחס לתמלול החושים של הגן הכתב ממקדם CMV. לאינטרון אורך של 490 bp, ואחריו אקסון II עם אתר I-SceI , ואזור קידוד הוכנס לשני תתי-מסגרות בכל מקום במסגרת. במורד הזרם של הגן UBB הוא רצף היוצר לולאת גזע 24x PP7 עם שעתוק הגן הכתב בכיוון תחושה (איור 1C).
ההדבקה החולפת של מבנה בלתי ניתן לתקדים של אנדונקולייז ביות I-SceI מאפשרת יצירה מבוקרת של DSB באתר הזיהוי שהוכנס בתוך כל גן כתב18. האנדונוקלאז I-SceI מותך במסגרת עם תחום מחייב ליגנד של קולטן הגלוקוקורטיקואיד וחלבון פלואורסצנטי אדום בהרבה iRFP713. מבנה זה הוא ציטופלסמי בהיעדר אצטוניד טרימצינולון (ת”א), אך נודד במהירות לגרעין עם הוספת ת”א למדיום הצמיחה של התאים (איור 1D). הגיוס של DSBs על ידי מערכת I-SceI הוא חזק, כפי שהוכח לפני 18,19,20. ניתן לעקוב אחר תמלול הגנים של הכתב במקביל על ידי הדמיית מערכות לולאת גזע RNA מתויגות באופן פלואורסצנטי MS2 ו- PP7.
קונפליקטים בין תהליכים ביולוגיים חיוניים כגון שכפול, שעתוק, נזק לדנ”א ותיקון DNA זוהו כמקור קריטי לחוסר יציבות בגנום22. מחקרים אלה הובילו גם לגילוי תמלול באתרים של נזק לדנ”א וייחסו תפקיד תפקודי לתעתיקים הנגרמים על ידי שבירה בוויסות תהליכי תיקון נזקי DNA23. הכלים החדשים והפרוטוקול המתואר כאן מאפשרים חקירה נוספת של דינמיקת התמלול של RNA Pol II ב- DSBs. נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא יצירת קווי תאים המכילים עותק יחיד של הגן הכתב המשולב בגנום. תכונה מרכזית זו מבטלת את הרעש שנוצר על ידי תמלול של מספר גנים עיתונאיים המשולבים עם עותקים מרובים בתוך לוקוס גנומי אחד ומאפשרת איסוף של פרמטרים קינטיים של דינמיקת שעתוק ותעתיקי RNA בודדים. דרישה טכנית חיונית לבחון תמלול של שילובי גנים של כתב יחיד היא הזמינות של מערכת מיקרוסקופ המאפשרת זיהוי של תמלילי RNA בודדים המסומנים במערכת MS2 או PP7 בתאים חיים4,12. כאן, מיקרוסקופיה של תאים חיים מבוצעת במערכת דיסק ספינינג קונפוקלית המותקנת על מיקרוסקופ הפוך, המצוידת בלייזרים במצב מוצק של 100 מגה-ואט בשילוב עם מסנן טונה אקוסטי-אופטי כמתואר במקום אחר24. יתר על כן, כדי ללמוד תמלול ב- DSB יחיד באמצעות הכתבים, תאים בודדים חייבים להיות במעקב קפדני כדי להשיג את רזולוציית הזמן הגבוהה ביותר, הדורשת תאי הדמיה במשך מספר שעות, מה שהופך את זה לבדיקת תפוקה נמוכה. ובכל זאת, אנו מתבוננים במספר תאים במקביל למיקום הנשלט על ידי שלב מיקרוסקופ מונחה פיזו. להבטחת תנאים סביבתיים אופטימליים לתצפית על תאים חיים במשך שעות, גוף המיקרוסקופ, כולל שלב הדגימה, ממוקם בתוך תא סביבתי פרספקס. בנוסף, תא דגירה בשלב סגור מותקן על במת המיקרוסקופ ומחובר לבקרי אספקת CO2 ולחות.
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא בחירת אזורי עניין עם תאים להדמיה. כל מיקום XY המסומן להדמיה חייב להכיל תא אחד או יותר המציגים טרנספקטציה עם חלבונים מחייבים לולאת גזע RNA פלואורסצנטית בהתאם לגן הכתב ולתוכנית הטרנספקטיון המתוארים בסעיף 1, טבלה 1, וכן באיור 2D, E. יתר על כן, התאים חייבים להציג אתרי שעתוק בעלי תווית בהירה חייבים להיות מודבקים במשותף עם מבנה I-SceI-GR-iRFP713, ויש למקם את החלבון בתחילה בציטופלזמה (איור 2D ו- E).
התאים צריכים להראות רמת עוצמת פלואורסצנטיות של חלבון מעיל MS2 ו/או PP7 לא מאוגד נמוך מספיק כדי לזהות תעתיקים מסומנים יחידים מעל רמת הפלואורסצנטיות ברקע. יחד עם זאת, יש צורך ברמת עוצמת פלואורסצנטיות חזקה של חלבוני הציפוי MS2 ו/או PP7 המתויגים באופן פלואורסצנטי כדי לאפשר הדמיה מעל 60 דקות לפחות מבלי לאבד יותר מדי פלואורסצנטיות עקב כמה אקונומיקה המתרחשת. “תצוגת תמונת קנה מידה” עם טווח קבוע כמתואר בסעיף 3.7 משמשת כדי לאפשר בחירה סטנדרטית של תאים בהתאם לרמת עוצמת הפלואורסצנטיות שלהם.
שלב פרוטוקול קריטי שני הוא הוספת הת”א לתאים על עמדות XY שנקבעו מראש דרך החור הקטן במכסה של צלחת התחתונה זכוכית. כל מניפולציה של צלחת התחתונה זכוכית תגרום לשינוי מעמדת XY המסומנת של התאים ויש להימנע. לכן, טיפול זהיר במיקרופיט תוך הוספת הת”א המדולל במדיום הצמיחה התאית חיוני לתצפית המוצלחת של התאים שנבחרו מראש, כפי שהודגם באיור 2F. הסתגלות של מערכות שונות להוספת תרופות לתאים המותקנים על במת מיקרוסקופ, כגון מערכת זלוף, תדרוש תא דגירה שלב נפרד עם פתחי כניסה ויציאה של צינור ומערכת משאבה או הזרקה לניהול תרופות. שיטות אחרות כגון שקופיות ערוץ עם משטחים תחתוניים דמויי כיסוי לגרום דיפוזיה איטית של תרופות מנוהלות לתוך הערוץ ולגרום לעיכוב נוסף בין תוספת סמים והשפעה. לבסוף, צנרת לא אותנטית לתוך פתח שקופית ערוץ עשוי לשנות את המיקום לדוגמה גם כן. לכן, המערכת הנוכחית עם חור קדח מותאם אישית במכסה של צלחת תחתית זכוכית היא פשוטה להתאמה, עלות נמוכה, ומתאים לניהול מדיה צמיחה שונים, תרופות, ורכיבים. הקוטר הקטן של החור והאטמוספירה הלחות בתא הדגירה של הבמה מונעים גם הם ייבוש מתוך המדיום של התא.
צעד קריטי שלישי בפרוטוקול זה הוא ניתוח הנתונים, הדורש בדיקה ידנית של נקודות הזמן כאשר התמלול נפסק עקב אינדוקציה של DSB. נקודת הזמן של סיום התמלול מסומנת על ידי שחרור התמלילים האחרונים מהאתר שכותרתו הבהירה בעבר של תמלול הגנים של הכתב. באופן דומה, האירועים של ייזום תמלול המושרה על ידי שבירה חייבים להיבדק בזהירות כדי לזהות אירועי שעתוק בודדים עם יחס אות לרעש נמוך יחסית של mRNAs פלואורסצנטי יחיד.
הדינמיקה של תיקון DSB המושרה מוסיפה שכבה נוספת של מורכבות לנתחים של נתונים שנוצרו באמצעות כתבים אלה, ומגבילה אותם לדקות הראשונות מיד לאחר גיוס ה- DSB. האופי הטרנסגני של גנים עיתונאיים והאופי העשיר החוזר של מערכי לולאת הגזע MS2 ו- PP7 עשויים להרכיב נוף כרומטין ייחודי, ולהפריע להקמת תוכניות שעתוק יציבות. עם זאת, בהשוואה להקרנה מייננות או UV, אינדוקציה תיווך I-SceI של DSB בגנים עיתונאיים היא מערכת הרבה יותר חזקה לחקור תמלול ב- DSBs בודדים.
ניתן לשלב מערכות אנדונוקלאז שונות כגון I-CreI, I-PpoI או AsiSI שיש להן או אין להן אתרי זיהוי נוספים בתוך הגנום האנושי עם מערכות הגנים הכתב הנוכחיות ליעילות גבוהה יותר אפשרית של יצירת DSBs. עם זאת, הם דורשים תחילה להציג את אתר זיהוי אנדונוקלאז לתוך הגנים העיתונאים. שנית, ייתכן שיש להם שונות דומה על התזמון ואת האינדוקציה היעילות של DSB בתאים בודדים. מצד שני, הוספת עותקים דו-מושביים של אתרי זיהוי אנדונקולאז עשויה להגביר את היעילות של אינדוקציה DSB. יתר על כן, בדיקת מערכות הגנים העיתונאיות המוצגות בשורות תאים שונים תאפשר השוואה של דינמיקת שעתוק באתרי DSB בין רקעים תאיים שונים לבין הזמינות של מסלולי תיקון נזקי DNA שונים כגון בתאים סרטניים, תאים ראשוניים ותאים שאינם רוכבי אופניים מובחנים. עם זאת, בניית הגנים הכתב להיות תואם עם מערכת Flp / FRT מגבילה כעת את האינטגרציה לתוך קווי תאים מארחים Flp / FRT זמין.
בנוסף ליישומים מבוססי מיקרוסקופיה, הגנים הכתב הנוכחי עשויים להיות משולבים גם עם בדיקות ביוכימיות, כגון אימונופרציפיטציה כרומטין, כדי לחקור את הגיוס של גורמי תיקון DNA או שעתוק ל- DSB יחיד או כדי להעריך תפוסת נוקלאוזום, שינויים histone, ומצב כרומטין סביב אתר DSB. יתר על כן, שילוב עם מערכות עיתונאיות שונות יאפשר לחקור קשרים פונקציונליים בין נזק לדנ”א ותהליכים כמו ארגון גנום או שכפול DNA.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לזינגר RH, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca על מתנות של פלסמידים וריאגנטים. אנו גם אסירי תודה לצוות מתקן הביו-הדמיה של IMM, א. טמודו, א. נסימנטו וג’יי רינו, לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי PTDC / MED-OUT / 32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 ו-PTDC/MED-OUT/4301/2020 מ Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), פורטוגל ועל ידי LISBOA-01-0145-FEDER-007391, פרויקט במימון משותף של FEDER דרך POR Lisboa, פורטוגל 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa ו- FCT. המימון התקבל גם מתוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי Horizon 2020 (RiboMed 857119). תואר שני הוא מקבל מלגת FCT לדוקטורט 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |